AÇÃO ANTIMICROBIANA DE EXTRATOS DE ESPECIARIAS FRENTE A ESTIRPES DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS ISOLADOS DE MASTITE SUBCLÍNICA
Capítulo de livro publicado no livro do I Congresso Internacional em Ciências da Nutrição. Para acessa-lo clique aqui.
DOI: https://doi.org/10.53934/9786585062015-4
Este trabalho foi escrito por:
Vanusa Alves de Oliveira *; Marilene da Silva Lima ; Juan Carlos da Silva Nascimento ; Thibério Pinho Costa Souza ; Anamélia Sales de Assis ; Betânia Araújo Cosme dos Santos ; Raimundo Bernadino Filho
* Vanusa Alves de Oliveira – [email protected]:
Resumo: Os bioconservantes tem chamado a atenção de pesquisadores por apresentar efeitos promissores em substituição aos agentes químicos. O objetivo desse trabalho foi verificar a ação antimicrobiana especiarias sobre microrganismos patogênicos. A pesquisa foi realizada no laboratório de biologia animal da Universidade do Agreste Pernambucano. Foram utilizadas as especiarias: cravo (CRV); orégano (ORG); manjericão (MAN); Noz moscada (NOZ); zimbro (ZBR); alecrim (ALE) e louro (LRO). As amostras foram trituradas e posteriormente foram pesados 10 gramas de cada especiaria e adicionados 100 mL de álcool (96%). As soluções foram armazenadas (26°C) por 120 horas. Em seguida foram filtradas e evaporadas a 40 °C. Foram utilizadas as seguintes estirpes de Staphylococcus aureus: 4R, 5S, 14S, 410, 413 e 591 no antibiograma. Para o controle, foram utilizados S. aureus ATCC 12600 e E. coli ATCC 8739. Discos de papel (10 mm) receberam 30 µL do extrato das especiarias, individualmente. Sobre estes, foi vertido ágar BHI contendo uma concentração de 108 UFC/mL do inóculo. As linhagens também foram submetidas a testes com antimicrobianos comerciais: Amoxilina + ácido clavulânico (10/20µg), Gentamicina (10µg), ácido nalidixico (30µg) e cefalotina (30µg). Todas as amostras foram incubadas a 37°C por 18 horas. A atividade antimicrobiana foi verificada pela visualização de halos de inibição em torno de cada disco. Os resultados demostraram que dos extratos de alecrim e cravo foram os mais eficientes entres os testados. Louro, manjericão e orégano não apresentaram nenhuma atividade antimicrobiana. A amoxilina associada com o ácido clavulânico obteve a melhor ação inibitória nos microrganismos testados.
Palavras–chave: Especiarias; Bioconservantes; Patógenos;
Abstract: Biopreservatives have drawn the attention of researchers for showing promising effects in substitution of chemical agents. The objective of this work was to verify the antimicrobial action of spices on pathogenic microorganisms. The research was carried out in the animal biology laboratory of the Pernambucano Wild University. The following spices were used: cloves (CRV); oregano (ORG); basil (MAN); Nutmeg (NUT); juniper (ZBR); rosemary (ALE) and bay leaf (LRO). The samples were ground and then 10 grams of each spice were weighed and 100 mL of alcohol (96%) were added. The solutions were stored (26°C) for 120 hours. Then they were filtered and evaporated at 40 °C. The following strains of Staphylococcus aureus were used: 4R, 5S, 14S, 410, 413 and 591 in the antibiogram. For control, S. aureus ATCC 12600 and E. coli ATCC 8739 were used. Paper discs (10 mm) received 30 µL of the spice extract, individually. On these, BHI agar containing a concentration of 108 CFU/mL of inoculum was poured. The strains were also tested with commercial antimicrobials: Amoxicillin + clavulanic acid (10/20µg), Gentamicin (10µg), nalidixic acid (30µg) and cephalothin (30µg). All samples were incubated at 37°C for 18 hours. Antimicrobial activity was verified by visualizing diameters of inhibition around each disc. The results showed that the rosemary and clove extracts were the most efficient among those tested. Bay leaves, basil and oregano did not show any antimicrobial activity. Amoxicillin associated with clavulanic acid obtained the best inhibitory action on the microorganisms tested.
Keywords: Spices; Biopreservatives; Pathogens;
INTRODUÇÃO
A mastite causada por bactérias tem grande impacto na produção de leite, resultando em grandes perdas financeiras (1). A presença da doença em animais leiteiros causada pelo Staphylococcus aureus, indicam riscos à saúde tanto do animal quanto do consumidor. É uma afecção de cunho multifatorial que tem nas inter-relações entre o hospedeiro, o ambiente e os agentes infecciosos como fatores determinantes para sua ocorrência (2). A doença acarreta prejuízos à indústria de laticínios devido a alterações na composição físico-química do leite, causadas pelas enzimas e ainda constitui ameaça à saúde dos consumidores devido à veiculação de patógenos e suas toxinas, ou pela presença de resíduos de antibióticos no leite (3). A infecção de origem alimentar é baixa em países que adotaram a pasteurização como procedimento obrigatório na produção de derivados do leite. O contrário acontece em regiões onde existe a prática do consumo de leites cru (4).
Conforme Franco (5), o Staphylococcus aureus é um dos microrganismos mais importantes na contaminação de alimentos particularmente por estar envolvido com a manipulação direta do alimento visto que sua via de transmissão se dá pelo contato manual do indivíduo infectado (secreção nasal). Os alimentos mais envolvidos em surtos são aqueles preparados sem refrigeração ou com muito tempo de antecedência ao consumo. São situações propícias para a produção das toxinas.
Antimicrobianos, extraídos de vegetais e de origem animal foi uma alternativa terapêutica criada por povos indígenas e da Ásia, há milênios, e tem-se fortificado nas últimas décadas, impulsionando as pesquisas sobre novos compostos, particularmente contra microrganismos multirresistentes. Nesse contexto, os experimentos têm evidenciado os potenciais antimicrobianos de diferentes espécies de folhas, frutas, méis, oleaginosas e sementes (6,7). Segundo Furlani et al. (8) estudos utilizando produtos extraídos de plantas para o controle do Staphylococcus aureus tem demonstrado resultados promissores. Além disso o Brasil possui uma flora rica a ser explorada nessas pesquisas e na biotecnologia na busca de novas substancias fitoterápicas.
De acordo com Nascimento (9), na da indústria alimentícia existe uma forte utilização de aditivos químicos com a finalidade de inibir o crescimento de patógenos e deteriorantes. Algumas alternativas comprovadas para a substituição destes produtos são ervas e temperos, tais como: cravo (Syzygium aromaticum), canela (Cinnamomum verum), coentro (Coriandrum sativum), alho (Allium sativum), gengibre (Zingiber officinale), tomilho (Thymus vulgaris), alecrim (Rosmarinus officinalis) e sálvia (Salvia officinalis). Estes podem ser utilizados tanto in natura como também nas formas de extratos, farinhas e óleos essenciais, os quais têm possibilidade de aplicação direta ou indireta, na forma de ingrediente na constituição de determinados alimentos.
Diante do exposto, o objetivo desse trabalho foi verificar qualitativamente, a ação de extratos de especiarias na inibição de estirpes de Staphylococcus aureus isolados de mastite bovina subclínica, na cidade de Garanhuns, PE.
MATERIAL E MÉTODOS
Esta pesquisa foi realizada no laboratório de biologia animal da Universidade do Agreste Pernambucano (UFAPE) no período de 02 a 22 de novembro de 2021.
2.2 Materiais
Nesse experimento foram utilizadas as especiarias: cravo (Syzygium aromaticum) – (CRV); orégano (Origanum vulgare) – (ORG); manjericão (Ocimum basilicum) – (MAN); Noz moscada (Myristica flagrans) – (NOZ); zimbro (Juniperus communis) – ZBR; alecrim – (Salvia rosmarinus) e louro (Laurus nobilis). Todas da marca Kivita, adquiridas na forma desidratadas, em supermercado local, na cidade de Garanhuns, PE.
2.3 Produção do extrato
As amostras foram trituradas até gramatura de 20 mash. Posteriormente foi produzido um extrato hidroalcóolico para cada uma delas. Para a produção do extrato, foram pesados 10 gramas de cada especiaria e em seguida adicionados de 100 mL de uma solução de álcool etílico a 96% em Erlenmayer. Estes ficaram a temperatura ambiente (26 °C) protegidos da luz por um período de 120 horas. Posteriormente foi realizada filtração em papel de filtro estéril. A solução foi levada para evaporar em estufa a 40 °C até peso constante. O material foi ressuspendido com água destilada estéril (10mL) e congelados a -18°C até o momento das análises (10).
2.4 Microrganismos e preparo do inóculo
Para o antibiograma foram utilizadas as seguintes estirpes de Staphylococcus aureus: 4R, 5S, 14S, 410, 413 e 591. Todas isoladas de bovinos com mastite subclínica. Esses, pertencentes a coleção de isolados da professora Elizabete Rodrigues, desta, instituição. Como microrganismos controle, foram utilizados S. aureus ATCC 12600 e E. coli ATCC 8739. Todos foram mantidos sob congelamento a -18 °C em caldo BHI. A reativação dos mesmos ocorreu 48 horas, antes do experimento, utilizando caldo BHI. Para preparo do inóculo, todos microrganismos foram previamente repicados em caldo BHI e incubadas a 37 °C por 24 horas antes do teste. A suspensão bacteriana foi preparada em tubos com solução salina a 0,85% até a turbidez conforme padrão MacFarland 0,5 (580 nm) que corresponde a concentração de 108 UFC/mL.
2.5 Teste antimicrobiano
A atividade antimicrobiana foi realizada por difusão em disco (10 mm). Discos de papeis receberam 50 µL do extrato das especiarias, individualmente. Este foi colocado numa placa contendo ágar Miller Hinton. Em seguida, foi vertido sobre os discos, uma suspensão de ágar BHI contendo o inóculo bacteriano (10µL). As amostras foram incubadas a 37 °C por 18 horas. A atividade antimicrobiana foi verificada pela visualização de halos de inibição em torno de cada disco e medido com régua milimetrada. As análises foram realizadas em duplicatas. As estirpes também foram submetidas a teste com discos de antimicrobianos comerciais: Amoxilina + ácido clavulânico (10/20µg), Gentamicina (10µg), ácido nalidixico (30µg) e cefalotina (30µg).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Conforme resultados da Tabela 1. Pode-se observar que os extratos de cravo (CRV) e alecrim (ALE) e zimbro (ZBR) mostraram inibição sobre os microrganismos utilizados nesse estudo, exceto para a E. coli 8739 essa foi resistente a todos os extratos testados. Segundo Albuquerque et al. (11) ao avaliar a eficiência de extratos vegetais sobre microrganismos, vários fatores devem ser considerados. Entre eles, as condições de produção da planta teriam relação direta com o tipo de constituinte presente, e consequentemente, ação direta sobre o tipo de microrganismo estudado. Ainda, bactérias Gram – geralmente não são afetadas por extratos vegetais. Quando essas apresentam sensibilidade a esses extratos, pode estar relacionado com a presença de saponinas, flavonoides e alcaloides nesses. Chesca et al. (12), investigando a eficiência de óleo essencial de cravo da índia, na inibição de Salmonella e E. coli observaram inibição da primeira e resistência dessa última, corroborando com os dados desse experimento
O extrato de alecrim (Figura 1) apresentou um melhor potencial de inibição entre todos os extratos investigados. Os extratos de orégano, louro e manjericão não mostraram ação antimicrobiana em nenhuma linhagem testada. Melo et al. (13) testaram diferentes extrato de especiarias em estirpes de S. aureus e verificaram que os extratos de cravo e orégano foram capazes de inibir o crescimento das linhagens, tendo uma produção de halo de 11 e 9 mm respectivamente. Binatti (14) investigando a ação antimicrobiana de especiarias em S. aureus, verificou a inibição do cravo da índia com sobre está com 12 mm de halo. Entretanto Cruz (15) testou extrato hidroalcóolico do orégano em S. aureus obtendo halo superior a 30 mm de diâmetro.
Cutrim et al. (16) investigaram a ação de extratos aquosos, utilizando gengibre e alecrim na concentração de 2mg (massa do extrato) /mL, sobre espécies de Staphyloccus aureus e observaram que os microrganismos foram sensíveis aos extratos, produzindo uma zona de inibição de 10,7mm e 10mm respectivamente. De acordo com Porte (17) a inibição de extratos vegetais sobre microrganismos, está relacionada com o efeito sinérgico de seus diferentes constituintes fito-químicos como: taninos, fenóis, flavonóides e alcalóides. Esses, sensibilizam a bicamada lipídica da membrana, alterando a atividade dos canais de cálcio, ocasionando uma maior permeabilidade dos constituintes intracelular. Esses constituintes são liberados causado a morte celular. Ainda, segundo o autor, outra explicação, está nos possíveis danos que enzimas, presentes nos microrganismos, podem sofrer. ALBUQUERQUE et al. (11) preparou diferentes tipos de extratos utilizando folhas de jamelão, jambo e goiabeira em na proporção de 1:10, planta em pó/diluente, a fim de inibir o Staphylococcus aureus. Entretanto o microrganismo foi resistente as todas as concentrações testadas (25 mg/mL, 50 mg/mL e 100mg/mL). Esse atribui a ineficiência dos extratos utilizados, em sua pesquisa, com a baixa concentração dos princípios ativos nos mesmos. Tal fato poderia explicar o baixo desempenho dos extratos utilizados nesse experimento.
Os dados da atividade antimicrobiana dos fármacos podem ser vistos na Tabela 2. Verificou-se que a maioria das estirpes foram sensíveis aos fármacos comerciais. Apenas a linhagem 410 apresentou resistência ao ácido nalidíxico.
Segundo Meng et al. (18), a resistência a drogas, pode estar relacionada a fatores como a exposição excessiva a antibióticos e com o uso subterapêutico na prevenção de doenças. A associação da amoxilina com o ácido cluvilânico foi bastante efetivo no controle das linhagens, particularmente na 413.
CONCLUSÕES
Conforme as condições desse experimento, pode-se inferir que os extratos de alecrim e de cravo da índia, apresentam potencial para inibir os microrganismos testados. Os extratos a partir do louro, manjericão e orégano não demonstraram nenhuma atividade de inibição nas linhagens estudadas. Entretanto, por se tratar de um experimento exploratório, faz-se necessário um estudo para quantificar as concentrações necessárias para resultados mais promissores.
O fármaco amoxilina em associação com o ácido clavulânico demonstrou, ser mais eficiente no controle dos microrganismos que os demais fármacos.
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