O controle microbiano é uma preocupação constante na indústria de alimentos. A utilização de conservantes naturais para alimentos, bem como de embalagens bioativas capazes de inibirem e/ou inativarem o crescimento bacteriano vem ganhando atenção. Nesse cenário, no presente trabalho objetivou-se avaliar a atividade antimicrobiana de filmes bicamada à base de amido de batata-doce com óleo essencial de tomilho (Thymus vulgaris) (OET) encapsulado em nanofibras de zeína contra as bactérias Escherichia coli e Staphylococcus aureus. O filme foi produzido pela técnica de casting e as nanofibras de zeína com óleo essencial encapsulado por meio da técnica de electrospinning. A avaliação in vitro da atividade antimicrobiana foi determinada pelo método de microatmosfera. Os resultados indicaram atividade antimicrobiana na concentração de 65% (p/v) do OET contra as bactérias testadas. Houve redução de 97% e 90% para S. aureus e E. coli, respectivamente. Deste modo foi possível concluir que o filme bicamada antimicrobiano apresenta potencial para uma possível aplicação como embalagem ativa para alimentos.