INFLUÊNCIA DO TEMPO FERMENTAÇÃO NA VISCOSIDADE DOS SOROS DE LEITE BOVINO E CAPRINO UTILIZANDO Lactiplantibacillus plantarumCNPC001

Capítulo de livro publicado no livro do VIII ENAG E CITAG. Para acessa-lo  clique aqui.

DOI: https://doi.org/10.53934/786585062046-18

Este trabalho foi escrito por:

José Honório Pereira Lopes Neto^1,* ; Saionara Soares¹ ; Maria Isabel Ferreira Campos¹ ; José Evangelista Santos Ribeiro² ; Kerolayne Santos Leite³ ; Caroline Mellinger-Silva⁴ ; Haíssa Roberta Cardarelli¹

¹Universidade Federal da Paraíba, UFPB, Campus I, CEP 58051-900, João Pessoa, Paraíba, Brasil.

²Universidade Federal da Paraíba, UFPB, Campus III, CEP 58220-000, Bananeiras, Paraíba, Brasil.

³Programa de pós-graduação em Engenharia Mecânica, Departamento de Engenharia Mecânica, Universidade Federal da Paraíba, João Pessoa, PB 58051-900, Brasil.

⁴EMBRAPA Agroindústria de Alimentos, Avenida das Américas, 29501, Rio de janeiro, RJ 23020-470, Brasil.

*Autor correspondente (Corresponding author) – Email: [email protected]

Resumo: O soro de leite é um importante subproduto da indústria láctea que pode causar danos ambientais irreversíveis, se descartado inadequadamente. Entretanto, pelo seu alto valor nutritivo, tem sido estudado como substrato de processos fermentativos por bactérias ácido láticas (BAL). As BAL são microrganismos com capacidade de produção de diversos compostos, entre eles os bioativos como os exopolissacarídeos (EPS). Os EPS podem influenciar em alguns parâmetros reológicos como a viscosidade dependendo do tempo de fermentação ao qual é submetido. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do tempo de fermentação na viscosidade do soro de leite bovino e caprino utilizando Lactiplantibacillus plantarumCNPC001. Avaliou-se o pH, a viabilidade celular, os açúcares totais e a viscosidade durante o perído de fermentação de 0, 24, 48 e 72 horas. Constatou-se a maior viabilidade com 48 h de fermentação, tanto no soro bovino quanto no caprino (11,66 ± 0,06; 11,61 ± 0,06 Log UFC/ mL) respectivamente. O pH dos soros caprino e bovino atingiu 3,78 e 4,93 após 72 h de fermentação. A viscosidade e o teor de açúcares totais foram maiores no soro caprino após 72 h (cerca de 50,00 g/ L), enquanto o soro bovino apresentou maior viscosidade e teor de açúcares no tempo 24 h (54,88 g/ L). Portanto ambos os soros se apresentam como fonte alternativa de meio de cultura de baixo custo para fermentação de BAL, sendo necessário otimizar conjuntamente os parâmetros de tempo e composição do meio visando maior produção de açúcares do tipo EPS.

Palavras–chave: autóctone; bactérias láticas; exopolissacarídeos

Abstract: Whey is an important by-product of the dairy industry that can cause irreversible environmental damage if improperly disposed of. However, due to its high nutritional value, it has been studied as a substrate for fermentation processes by lactic acid bacteria (LAB). LAB are microorganisms capable of producing several compounds, including bioactive ones such as exopolysaccharides (EPS). EPS can influence some rheological parameters such as viscosity depending on the fermentation time to which it is subjected. The objective of this work was to evaluate the effect of fermentation time on the viscosity of bovine and goat milk whey using Lactiplantibacillus plantarum CNPC001. The pH, cell viability, total sugars and viscosity were evaluated during the fermentation period of 0, 24, 48 and 72 hours. The highest viability was observed with 48 h of fermentation, both in bovine and goat serum (11.66 ± 0.06; 11.61 ± 0.06 Log CFU/ mL) respectively. The pH of goat and bovine serum reached 3.78 and 4.93 after 72 h of fermentation. Viscosity and total sugar content were higher in goat whey after 72 h (about 50.00 g/L), while bovine whey showed higher viscosity and sugar content at 24 h (54.88 g/L). Therefore, both sera present themselves as an alternative source of low-cost culture medium for LAB fermentation, being necessary to optimize the time parameters and composition of the medium together, aiming at greater production of EPS-type sugars.

Keywords: autochthonous; lactic bactéria; exopolysaccharides

INTRODUÇÃO

            As bactérias ácido láticas (BAL) têm como principal característica a geração de ácido lático a partir da fonte de carbono presente ou suplementado no meio de cultura, entretanto diversas cepas também produzem outros compostos como peptídeos bioativos, compostos antibacterianos, aromáticos e exopolissacarídeos (EPS) durante o processo metabólico desses microrganismos (1, 2).

            Os EPS microbianos podem estar presentes em uma grande variedade de produtos alimentícios fermentados e atuam como agentes viscosificantes, estabilizantes, emulsificantes, gelificantes e ingredientes funcionais podendo também aumentar a viabilidade probiótica (2, 3).

            O soro de queijo é um fluido de coloração amarelo-esverdeada que permanece após a remoção de gordura e caseína do leite durante fabricação de queijos (4, 5). Pode ser classificado como ácido (resultado da fermentação lática) ou doce (obtido pela adição de coalho). Além disso, é o principal subproduto da fabricação de queijos e ainda é considerado um dos principais resíduos da indústria de laticínios, e também é o mais contaminante. O descarte inadequado pode causar excesso de consumo de oxigênio, eutrofização e toxicidade nos ambientes receptores. A indústria aproveita apenas cerca de 10% do soro, transformando-o em concentrado de proteína de soro (4) ou na produção de ricota, queijo cottage e bebidas lácteas para comercialização. Ademais, pequena parte ainda é utilizada para alimentação animal, diminuindo os custos com o descarte inadequado ou a geração de poluição (6).

            Esse subproduto lácteo possui propriedades nutricionais variáveis, que dependem da raça e espécie do animal, alimentação, tipo de queijo e do processo de fabricação do produto. Apresenta valores de pH que variam entre 4,3 e 6,6, constituído por cerca de 93 a 94% de água, 12% minerais, 10% vitaminas, principalmente do complexo B. Estão presentes também proteínas, lipídeos, enzimas proteolíticas, ácidos orgânicos (ácido cítrico e lático), substâncias nitrogenadas proteicas e não proteicas (7, 4, 8). É um substrato promissor para a geração de biopolímeros através do emprego de culturas microbianas fermentadoras, principalmente as BAL (9). Pode ser utilizado para fabricação de produtos alimentícios e como meio de cultura para BAL. Têm-se comprovado as propriedades e compostos bioativos presentes, valorizando essa matéria-prima (8, 6).

Alguns estudos tem apontado que concentrações mais altas de nitrogênio no meio de cultivo favorecem o crescimento celular microbiano, enquanto que para maior produção de EPS menores concentrações tendem a ser mais favoráveis (10, 11, 12). Assim, a desproteinização do soro pode elevar a produção de exopolissacarídeos que interferem diretamente na viscosidade do meio.

            Portanto, visando minimizar o problema de subaproveitamento do soro, é necessário realizar uma mudança de paradigma nos produtores, que lhes permita incorporar processos e tecnologias para o aproveitamento integral do soro de leite, de acordo com suas capacidades econômicas e tecnológicas.

            Diante do exposto, o objetivo deste estudo foi avaliar a influência do tempo fermentação na viscosidade dos soros de leite bovino e caprino utilizando Lactiplantibacillus plantarum CNPC001.

­ MATERIAL E MÉTODOS

      As cepas probióticas autóctones de Lactiplantibacillus plantarum CNPC001 foram cedidas pela Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária – EMBRAPA Caprinos e Ovinos (Sobral, CE, Brasil), da “Coleção de Microrganismos de Interesse para a Indústria de Alimentos”, registradas no patrimônio genético sob o registro de acesso A925322 do Sistema Nacional de Gestão do Patrimônio Genético e Conhecimentos Tradicionais Associados – Sisgen, do Ministério do Meio Ambiente, realizado em 30/05/2018.

O leite caprino utilizado para fabricação dos queijos e coleta dos soros foi adquirido do Sítio Barriguda (Alagoa Grande, Paraíba) e o leite bovino pasteurizado foi adquirido no mercado local (João Pessoa, Paraíba) da marca Betânia Lácteos S/A (Morada Nova, Ceará). Os soros de queijo caprino e bovino foram obtidos pela produção de queijo minas frescal no Laboratório de Processamento de Alimentos do Centro de Tecnologia e Desenvolvimento Regional (CTDR), Universidade Federal da Paraíba (João Pessoa, Paraíba).  As amostras do soro foram mantidas sob congelamento (-18 °C ± 2 °C) em recipientes de PVC estéreis com capacidade de 500 mL até utilização.

O estudo buscou um protocolo escalonável, aplicável e reprodutível na indústria de laticínios, por isso optou-se pela desproteinição aplicando processo de tratamento térmico em autoclave a 100 °C com fluxo de vapor constante e alcançar o ponto isoelétrico das proteínas presentes no soro para desnaturação das mesmas, seguidos de filtração e centrifugação (13, 14).

Assim, os soros foram descongelados e centrifugados no laboratório de Microbiologia  do Centro de Tecnologia e Desenvolvimento Regional (CTDR), Universidade Federal da Paraíba (João Pessoa, Paraíba) em centrífuga de bancada (Eppendorf Centrifuge 5430 R, Hamburgo, Alemanha) a 6.500 rpm, 4 °C durante 10 minutos a fim de eliminar resíduos de caseína e gordura. Posteriormente, seu pH foi corrigido para 4,3 com auxílio de HCl 1 M, de acordo com procedimento descrito na literatura (4), a fim de provocar a precipitação de caseínas residuais. Em seguida, os soros foram aquecidos em vapor fluente (100 °C) por 30 minutos à pressão atmosférica. Logo após, resfriou-se e ajustou-se o pH para 6,8 com auxílio de NaOH 1 M. Os soros foram então centrifugados a 6.500 rpm, 4 °C durante 10 minutos.

A fermentação dos soros envolveu a reativação da cepa de L. plantarum por inoculação em caldo MRS padrão, incubado por 24 h/ 37°C. Um segundo repique foi realizado sob as mesmas condições, as células foram centrifugadas (9000 x g, a 4 ºC/ 10 min), lavadas duas vezes com água peptonada e ressuspendidas em água destilada estéril com a densidade ótica ajustada entre 1,5 e 1,6 (8 logs UFC/ mL), para serem inoculadas nos soros que previamente foram suplementados com 10% de glicose (p/v). Os soros foram fermentados em condições de aerobiose a 37 ± 2 ºC. As amostras foram coletadas após 24, 48 e 72 h, quando foram centrifugadas (9000 x g, a 4 ºC/ 10 min) para posterior análise de viscosidade, viabilidade probiótica e medição do pH.

            O pH foi medido em potenciômetro de bancada (MB10, Marte, , Minas Gerais, Brasil) de acordo com a AOAC (2016).

            A viabilidade de cepas de L. plantarum foi realizada por cultivo em ágar MRS (Kasvi, São José do Pinhais, Brasil) a 37 ± 2 ºC/ 48 h em condições anaeróbicas.

A determinação do teor de açúcares totais foi feita pelo método de antrona, conforme descrito por Yemm; Willis (16). Foram utilizadas glicose e água destilada para obtenção da curva padrão e para o branco, respectivamente. Uma alíquota de 5,0 mL do reagente de antrona foi adicionada às amostras nos tubos de ensaio contendo 1,0 mL de extrato aquoso; nos tubos contendo amostras de padrão de glicose (Sigma®); e nos tubos contendo água destilada. A absorbância foi medida em um espectrofotômetro (BioPhotometerD30, Eppendorf, Hamburgo, Alemanha), a 620 nm.

A viscosidade foi medida utilizando um viscosímetro de tubo capilar de Ostwald 150 (Special Glass, São Paulo, SP, Brasil), em banho termostático (Jubalo, Buenos Aires, Argentina) a 25 °C. O cálculo da viscosidade empregou a constante k = 0,03306 mm²/s para o viscosímetro utilizado. O volume de 20 mL soro fermentado foi colocado no reservatório superior com tubo de diâmetro maior, a partir do qual ele foi descarregado através de um tubo capilar. Foi realizada sucção no tubo de menor diâmetro de modo que o fluido passasse a escoar lentamente por gravidade cruzando a primeira marca de volume. O tempo de escoamento foi medido entre duas marcas e registrado com auxílio de cronometro.

O cálculo da viscosidade empregou a fórmula: ν = k _x t (mm²/s), onde ν é a viscosidade, k a constante relacionada ao viscosímetro utilizado, e t tempo de escoamento do líquido analisado.

As amostras foram analisadas em 0, 24, 48 e 72 h, visando comparar a viscosidade, quantidade total de carboidratos presentes para cada soro fermentado e viabilidade dos microrganismos. Todos os experimentos bem como as análises foram realizadas em triplicata.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

            A viabilidade de Lactiplantibacillus plantarum CNPC001 no soro apresentou diferenças estatíticas (p < 0,05) entre as amostras de soro caprino (7,84 ± 0,02 Log UFC/ mL) e bovino (8,78 ± 0,01 Log UFC/ mL) apenas no tempo inicial (logo após incubação). Quando se comparou os tempos 0, 24, 48 e 72 h, constatou-se a maior viabilidade com 48 h de fermentação, tanto no soro bovino que apresentou 11,66 ± 0,06 Log UFC/ mL quanto no caprino, com 11,61 ± 0,06 Log UFC/ mL. Houve um decréscimo de 1 (um) ciclo logarítmico após 72 h de fermentação para ambos os soros.

            A figura 1 apresenta os resultados do pH nos soros fermentados no decorrer do tempo. Embora os dois soros, caprino e bovino, tenham tido seu pH ajustado para 6,8 no momento de incubação, o soro caprino apresentou-se com pH de 5,5 logo após a inoculação das BAL, enquanto o bovino teve pH de 6,2.

O soro caprino apresentou o pH decrescente, atingindo valor de pH de 3,78 com 72 h de fermentação. Já o soro bovino atingiu pH de 5,55 com 48 h de fermentação e pH de 4,93 após 72 h de fermentação. Houve diferença (p < 0,05) entre o pH dos soros em todos os tempos analisados.

Os gráficos do comportamento da viscosidade e teor de carboidratos totais dos soros fermentados durante o período de fermentação de 72 h são apresentados na figura 2. O comportamento da viscosidade no soro caprino gerou uma curva ascendente, atingindo a maior viscosidade em 72 h e também, maior quantidade de açúcares totais e menor pH.

Este resultado demonstrou que o soro caprino suplementado com glicose necessita de mais tempo de fermentação para atingir maior viscosidade, o que pode estar relacionado à produção de exopolissacarídeos pela cepa em estudo, visto que houve maior quantidade de açúcares totais presentes no meio.

Enquanto o comportamento da viscosidade no soro bovino pode ser representado uma parábola, o inverso ocorreu com o soro caprino, que atingiu maior viscosidade nos tempos 24 e 48 h. No entanto o teor de açúcares mais elevado (54,88 g/ L) foi obtido no soro bovino após 24 h de fermentação, embora tenha diminuído nesse soro nos tempos 48 e 72 h. Esses resultados pressupõem que o tempo de fermentação associado à constituição do meio pode influenciar diretamente na quantidade de EPS, conformepreviamente reportado por Chengcheng et al. (4).

Reportou-se que a fonte de carbono e a concentração do nitrogênio presentes no meio de cultura influenciam nas propriedades reológicas do EPS e na quantidade produzida, e a escolha da melhor razão entre a fonte de carbono e de nitrogênio pode ser determinada conforme o EPS a ser produzido (17). Além disso, outro estudo também demonstrou que uma alta concentração de EPS fez com que a viscosidade do meio de cultura aumentasse (18).

            Embora muitas BAL normalmente produzam pequenas quantidades de EPS, seu uso pode ser economicamente viável se os parâmetros de produção forem otimizados, substratos baratos forem utilizados, e o método de fermentação for econômico (19).

CONCLUSÕES

O comportamento da viscosidade foi promissor para determinar o tempo de incubação para o soro caprino e bovino, visando maior produção de açúcares, um indicativo significativo da quantidade de EPS produzido pela cepa utilizada. Houve diferença significativa no processo de fermentação do soro caprino e bovino pela BAL utilizada nessa pesquisa. L. plantarum necessita de mais tempo para fermentar o soro caprino em comparação com o soro bovino. Independentemente, ambos os soros podem ser utilizados como meio de cultura de baixo custo para fermentação de BAL, sendo necessário otimizar os parâmetros de tempo e composição do meio, visando maior produção de açúcares do tipo EPS. Este estudo confirma que cepas originárias de raças leiteiras que podem sintetizar níveis aceitáveis de EPS a serem empregados como ingrediente funcional na indústria alimentícia.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem à agência brasileira CAPES, pela bolsa de mestrado de Saionara Soares e à Universidade Federal da Paraíba, PROPESQ/PRPG, pela bolsa produtividade do projeto PVM 13515-2020.

REFERÊNCIAS

1. Liu Z, Zhang Z, Qiu L, Zhang F, Xu X, Au-Wei H, Au-Tao X. Characterization and bioactivities of the exopolysaccharide from a probiotic strain of Lactobacillus plantarum WLPL04. J dairy Sci. 2017;100:6895-6905.
2. Zhou Y, Cui Y, Qu X. Exopolysaccharides of lactic acid bacteria: Structure, bioactivity and associations: A review. Carbohydrate Polymers. 2019;207:317-3321.
3. Mileriene J et al. Effect of Indigenous Lactococcus lactis on physicochemical and sensory properties of thermo‐coagulated acid whey protein. J Food Proces and Preserv. 2021; 45:5.
4. Chengcheng L, et al. Bioconversion of cheese whey into a hetero exopolysaccharide via a one-step bioprocess and its applications. Bioc Eng J. 2020; 161:107701.
5. M’hir S, Rtibi K, Mejri A, Ziadi M, Aloui H, Hamdi M, Ayed L. Development of a Novel Whey Date Beverage Fermented with Kefir Grains Using Response Surface Methodology. J Chemistry. 2019;1:1-13.
6. Mazorra-Manzzano M Á, Moreno-Hernández J M, Properties and options for the valorization of whey from the artisanal cheese industry. Ciencia UAT. 2019;14:133-144.
7. Galdino I K C P O, Salles H O, Santos K M O, Veras G, Buriti F C A. Proximate composition determination in goat cheese whey by near infrared spectroscopy (NIRS). Peer Journal. 2020;8:8619.
8. Barukčić I, Jakopović K L, Božanić R. Valorisation of whey and buttermilk for production of functional beverages – An overview of current possibilities. Food Technol Biotechnol. 2019;57:448–460.
9. Zotta T, Solieri L, Iacumin L, Picozzi C, Gullo M. Valorization of cheese whey using microbial fermentations. Applied Microbiol Biotechnol. 2020; 104:2749–2764.
10. Herreira G C. Produção de exopolissacarídeos por rizóbios em meios de cultivo com coprodutos lácteos. Dissertação (Mestrado), Universidade Federal do Rio Grande, Rio grande, RS, 2019.
11. DE Oliveira J M, Amaral S A, Burkert C A V. Rheological, textural and emulsifying properties of an exopolysaccharide produced by Mesorhizobium loti grown on a crude glycerol-based medium. Int J Biol Macromol.2018;120:2180–2187.
12. Freitas F, Torres C A V, Reis M A M. Engineering aspects of microbial exopolysaccharide production. Bioresource Technol. 2017;245:1674–1683.
13. Boumaiza M, et al. Getting value from the waste: recombinant production of a sweet protein by Lactococcus lactis grown on cheese whey. Microb Cell Factories. 2018; 17:1-15.
14. Sampaio F C, et al. Batch growth of Kluyveromyces lactis cells from deproteinized whey: Response surface methodology versus Artificial neural network—Genetic algorithm approach. Bio Eng J. 2016;109:305-311.
15. Association of Official Analytical Chemists (AOAC), 2016.Official methods of analysis of the Association Official Analytical Chemists. v 4, 20th ed.
16. Yemm E, willis A J. The estimation of carbohydrate in plant extracts by Anthrone. Biochemical J, 1954;57:508-514.
17. Mattos M V C V, Trindade R A, Munhoz A P, Gautério F G A, Burkert C A V. Efeito da razão carbono/nitrogênio na produção e viscosidade de exopolissacarídeos de mesorhizobium loti semia 816 a partir de permeado de soro. 57º Congresso Brasileiro de Química, Gramado/RS, 2017.
18. Kujawska N, Talbierz S, Dębowski M, Kazimierowicz J, Zieliński M. Effect of the Concentration of Extracellular Polymeric Substances (EPS) and Aeration Intensity on Waste Glycerol Valorization by Docosahexaenoic Acid (DHA) Produced in Heterotrophic Culture of Schizochytrium sp. Appl. Sci. 2021;11:9573.
19. Korcz E, Varga L. Exopolysaccharides from lactic acid bacteria: Techno-functional application in the food industry. Trends in Food Sci Technol. 2021;110:375-384.