INFLUÊNCIA DO OXIGÊNIO NAS CONTAGENS DE LACTOBACILLUS BULGARICUSEM IOGURTES

Capítulo de livro publicado no livro do VIII ENAG E CITAG. Para acessa-lo  clique aqui.

DOI: https://doi.org/10.53934/9786585062046-56

Este trabalho foi escrito por:

Janeeyre Ferreira MACIEL*; Brenna Alves COSTA; Géssica Alexandre de BARROS; João Bosco Cavalcante da Silva SEGUNDO; Larissa Raphaela Gonçalves de Farias FEITOSA; Raquel Taynan Cunha VIEIRA

*Autor correspondente (Corresponding author) – Email: [email protected]

RESUMO: Neste trabalho, o objetivo foi avaliar a influência da incubação aeróbica e microaeróbica nas contagens de Lactobacillus bulgaricus em duas marcas de iogurtes naturais. Um total de cinco amostras, para uma das duas marcas, foi submetida as diluições decimais seriadas e subsequentemente ao plaqueamento em ágar MRS, utilizando-se a técnica pour plate. Para a incubação das placas, foram utilizadas duas condições: aeróbica e microaeróbica (8-10% oxigênio e 10% de gás carbônico), a 37 ºC por 48-72 horas. Os resultados obtidos demonstraram que não houve diferença significativa (p>0,5) entre as contagens de L. bulgaricus quando foram utilizadas condições aeróbicas e microaeróbicas na incubação das placas. Apesar de não haver diferença significativa no número de lactobacilos nas atmosferas testadas, foi possível observar aumento no tamanho das colônias em condições microaeróbicas, sugerindo que a menor exposição ao oxigênio favorece o desenvolvimento dos lactobacilos. Esse resultado propõe que o uso de jarra de anaerobiose para essa análise é dispensável, porém, por segurança, mais marcas deverão ser submetidas a esse estudo, para fins de confirmação.

Palavras-chave: bactérias láticas; fermentação lática; leite fermentado

Abstract: In this work, the objective was to evaluate the influence of aerobic and microaerobic incubation on Lactobacillus bulgaricus counts in two natural yogurt brands. A total of five samples, per brand, were subjected to serial decimal dilutions and subsequently to plating on MRS agar, using the pour plate technique. For the incubation of the plates, two conditions were used: aerobic and microaerobic (8-10% oxygen and 10% carbon dioxide), at 37ºC for 48-72 hours. The results obtained showed that there was no significant difference (p>0.5) between L. bulgaricus counts when aerobic and microaerobic conditions were used in the incubation of the plates. Although there was no significant difference in the number of lactobacilli in the atmospheres tested, it was possible to observe an increase in the size of colonies under microaerobic conditions, suggesting that less exposure to oxygen favors the development of lactobacilli. This result suggests that the use of an anaerobic jar for this analysis is unnecessary, however, for safety reasons, more brands should be submitted to this study, for confirmation purposes.

Keywords: lactic acid bacteria; lactic fermentation; fermented milk

1 INTRODUÇÃO

O iogurte natural padrão é um leite fermentado elaborado exclusivamente com ingredientes lácteos e obtido por ação simbiótica das bactérias láticas Streptococcus salivarius subsp. thermophilus e Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, (1). Essas bactérias láticas, quando consumidas juntas em iogurtes, em quantidades adequadas (≥10⁸ UFC/g) podem exercer efeitos benéficos a saúde humana segundo URIOT et. al. (2), mas para isso é preciso assegurar que os produtos contenham concentrações desses microrganismos, viáveis, até o momento do consumo.

Com esse intuito diversos estudos de monitoramento da viabilidade de bactérias láticas em iogurtes têm sido conduzidos em todo o mundo. A maioria desses estudos utilizaram contagens seletivas em ágar M17 e ágar MRS para S. thermophilus e L. bulgaricus, respectivamente, de acordo com a metodologia ISO 7889:2003 (3).

Entretanto, modificações nesse método são observadas, especialmente na contagem de L. bulgaricus, incluindo mudanças na concentração do oxigênio durante a incubação das placas. De acordo com o método de referência, a incubação deve ser conduzida em condições microaeróbicas, porém, não há especificação da faixa de concentração de oxigênio a ser usada.

Os resultados dessa contagem são utilizados para atestar que iogurtes comerciais apresentam as quantidades mínimas exigidas de bactérias láticas, e com isso, é de suma importância que os métodos selecionados para fazer com que essas investigações sejam confiáveis.

Dentre os sistemas comerciais mais utilizados nas contagens de L. bulgaricus destacam-se: Anaerocult C (Merck), com 5-15% de oxigênio e 8-10% CO₂, Gaspack anaerobic system (Oxoid), com menos que 1% de oxigênio e 4-10% CO_2, Anaeropack system (Mitsubich), com menos que 1% de oxigênio e 18% CO₂; BD Gaspack EZ campy container system, com 6-16% de oxigênio e 2-10% CO₂ e BD Gaspack EZ anaerobe container system, com <1% de oxigênio e 13% ou mais de CO₂.

Considerando a escassez de trabalhos que demonstrem os efeitos dessas variações nas concentrações de oxigênio sobre as contagens de L. bulgaricus em iogurtes, foi proposto nessa pesquisa verificar a influência da incubação aeróbica e microaeróbica nas contagens de L. bulgaricus em iogurtes.

2 MATERIAL E MÉTODOS

2.1 Coleta das amostras

Amostras de duas marcas de iogurtes naturais comerciais (produtos A e B) foram coletadas em supermercados da cidade de João Pessoa-PB, nos períodos de fevereiro à maio de 2021, sendo obtidas 05 unidades de amostras, por marca, todas de diferentes lotes. Essas marcas foram selecionadas, com base em estudos preliminares, por apresentarem números elevados de lactobacilos nas amostras analisadas (4). O transporte foi realizado em caixa isotérmica contendo gelo e no laboratório de microbiologia de alimentos da UFPB as amostras foram mantidas sob refrigeração até o momento das análises.

2.2 Contagens de Lactobacillus bulgaricus em iogurtes, utilizando-se condições aeróbicas e microaeróbicas de incubação

Amostras foram submetidas as diluições decimais seriadas, utilizando água peptonada 0,1% esterilizada (Merck, São Paulo, Brasil) e subsequentemente plaqueadas em ágar MRS (De Man, Rogosa e Sharpe) (HiMedia, Mumbai, India), utilizando-se a técnica pour plate. Uma bateria de placas, em duplicata, foi incubada em aerobiose a 37 ºC, por 48-72 horas, enquanto outra bateria preparada nas mesmas condições foram incubadas a 37 ºC, por 48-72 horas, em condições microaeróbicas, utilizando-se o sistema gerador microaerobac (Probac do Brasil), contendo 5-15% de oxigênio e 10% de CO_2.

Para a contagem, foram selecionadas as placas que apresentavam 25-250 colônias, sendo os resultados expressos em log UFC/g. Além das contagens, foi avaliada a morfologia das colônias obtidas sendo selecionados todos os tipos diferentes de colônias ou pelo menos 5 colônias idênticas por placa, para serem submetidas a coloração de Gram e teste de catalase.

Análise dos resultados

         Os resultados das contagens de L. bulgaricus foram submetidos as determinações de média, desvio-padrão, Análise de Variância (ANOVA) e ao pós-teste de Tukey, ao nível de significância de 5%. As análises estatísticas foram realizadas utilizando o software Graphpad Prism 8.0 .1.

3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Contagens de L. bulgaricus em iogurtes, utilizando-se condições aeróbicas e microaeróbicas de incubação

Na Tabela 1 estão apresentados os resultados das contagens de L. bulgaricus em iogurtes das marcas A e B, obtidas pela técnica pour plate, em condições de incubação aeróbica (PPA) e microaeróbica (PPM).

As contagens de L. bulgaricus nas amostras da marca A sob as duas condições de atmosfera estudadas ficaram em torno de 8,00 log UFC/g, não sendo observada diferença significativa entre as contagens devidas as condições de atmosfera (p>0,05). Nesse produto, os valores observados foram elevados, suficientes para atender a legislação quanto ao número de bactérias láticas totais (mínimo: 7 log UFC/g).   

As contagens nas amostras da marca B variaram de 6,50 a 7,50 log UFC/g em aerobiose, enquanto em condições microaeróbicas foram observados valores de 6,30 a 7,70 log UFC/g. Nos produtos dessa marca também não foi observada diferença significativa entre as contagens (p>0,05), sugerindo não ser necessária a utilização de jarras de anaerobiose para esse grupo de bactérias láticas, quando for utilizada a técnica de semeadura em profundidade.

As contagens de L. bulgaricus em iogurtes normalmente são realizadas utilizando-se condições microaeróbicas ou anaeróbicas e os resultados destas demonstram o bom crescimento dos lactobacilos (5,6). Porém, o uso de incubação aeróbica, especialmente quando utiliza-se a técnica spread plate, pode resultar em redução nas contagens de lactobacilos.

Em um estudo conduzido por BIROLLO et. al. (7) foram avaliadas condições aeróbicas e anaeróbicas na incubação das placas de ágar MRS para a contagem de L. bulgaricus em iogurtes, porém, utilizando a técnica spread plate.  Nessa pesquisa não foi possível recuperar lactobacilos em condições de aerobiose, tendo ocorrido crescimento desses microrganismos somente em condição anaeróbica (<1% oxigênio e 8-14% gás carbônico), com contagens acima de 7,00 log UFC/g.

Em outro estudo utilizando a técnica spread plate com incubação aeróbica foram obtidas contagens de lactobacilos abaixo de 7,0 log ufc/g, chegando a valores de até 1 log ufc/g após 21 dias de armazenamento (8).

Com relação a técnica pour plate, segundo BASBOSA et. al. (9) encontraram baixa viabilidade de L. bulgaricus utilizando a semeadura em profundidade com incubação aeróbica. Nesses estudos somente uma condição de atmosfera foi utilizada com incubação aeróbica. Poucos relatos foram encontrados na literatura pesquisada. Essa técnica é normalmente utilizada com algum recurso para redução do oxigênio como camada extra de meio de cultura (10), jarra de anaerobiose segundo GALLARDO-RIVERA et. al. (11) ou revestimento externo com parafilme segundo BABA et. al.(12).

            Ainda, foi observado que a marca B continha menos lactobacilos que a marca A, demonstrando assim a influência da marca nas contagens obtidas.

            Apesar de não haver diferença significativa no número de lactobacilos nas atmosferas testadas, foi possível observar aumento no tamanho das colônias em condições microaeróbicas, conforme demonstrado na Figura 1, sugerindo que a menor exposição ao oxigênio favorece o desenvolvimento dos lactobacilos.

4 CONCLUSÃO

            Os resultados obtidos demonstraram que não houve diferença significativa nas contagens de L. bulgaricus em iogurtes, quando a técnica pour plate foi usada, nas condições de incubação aeróbica e microaeróbica. Em contrapartida, percebeu-se que ao reduzir a exposição ao oxigênio na atmosfera houve um aumento no tamanho das colônias, mesmo não alterando de forma significativa a quantidade, mostrando um melhor crescimento.

           Esse resultado sugere que o uso de jarra de anaerobiose para essa análise é dispensável, porém, por segurança, mais marcas deverão ser submetidas a esse estudo, para fins de confirmação.

5 REFERÊNCIAS

1. BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA). Portaria n.46 de 23 de novembro de 2007: Regulamento Técnico de Identidade e Qualidade (PIQ) de Leites Fermentados, 2007.

2. URIOT, O.; DENIS, S.; JUNJUA, M.; ROUSSEL, Y.; DARY-MOUROT, A.; BLANQUET-DIOT, S. Streptococcus thermophilus: From yogurt starter to a new promising probiotic candidate?. Journal of Functional Foods, v. 37, p. 74-89, 2017.

3. ISO- International Standard Organization (2003) Yogurt – Enumeration of Characteristic Microorganisms – Colony-count Technique at 37 Degrees C (ISO 7889:2003). Geneva, Switzerland: International Organization of Standardization (IDF 117:2003).

4. COSTA, B. A. E MACIEL, J. F. Prevalência de Streptococcus Thermophilus em iogurtes comerciais produzidos no Brasil. Trabalhos premiados no XXVII Encontro de Iniciação Científica da UFPB: Editora UFPB, Série Iniciados 2018-2019, v. 25 ISBN: 978-85-237-1569-4, 2020.

5. SANTOS, E. C. da C. Avaliação da viabilidade de Lactobacillus Delbrueckii Subsp: Buus e Streptococcus Thermophilus no iogurte. Orientador: Stefania Marcia de Oliveira Souza. 2019. 22f. Trabalho de Conclusão de Curso (Bacharel em Medicina Veterinária) – Centro Universitário do Planalto Central Apparecido dos Santos, 2019.
6. DUDRIKOVÁ, Eva; NAGYOVÁ, Mária; DIčÁKOVÁ, Zuzana. Survival of Lactobacillus bulgaricus and Bifidobacterium animalis in yoghurts made from commercial starter cultures during refrigerated storage. Potravinarstvo, [S.L.], v. 11, n. 1, p. 597-601, 30 out. 2017. HACCP Consulting. http://dx.doi.org/10.5219/758.

7. BIROLLO, G.A.; REINHEIMER, J.A.; VINDEROLA, C.G.. Viability of lactic acid microflora in different types of yoghurt. Food Research International, [S.L.], v. 33, n. 9, p. 799-805, jan. 2000. Elsevier BV. http://dx.doi.org/10.1016/s0963- 969(00)00101-0.

8. RANASINGHE, J. G. S.; PERERA, W. T. R. Prevalence of Lactobacillus bulgaricus and Streptococcus thermophilus stability in commercially available yogurts in Sri lanka. Asian Journal of Medical Sciences (E-ISSN 2091-0576; P-ISSN 2467-9100), v. 7, n. 5, p. 97-101, 2016.

9. BARBOSA, P. M; GALLINA, D. A. Viabilidade de bactérias (starter e probióticas) em bebidas elaboradas com iogurte e polpa de manga. Revista do Instituto de Laticínios Cândido Tostes, [S.L.], v. 72, n. 2, p. 85-95, 1 jun. 2017. Lepidus Tecnologia. http://dx.doi.org/10.14295/2238-6416.v72i2.580.

10. HATI, S.; PATEL, N.; MANDAL, S. Comparative growth behaviour and biofunctionality of lactic acid bacteria during fermentation of soy milk and bovine milk. Probiotics and antimicrobial proteins, v. 10, n. 2, p. 277-283, 2018.

11. GALLARDO-RIVERA, C., BÁEZ-GONZÁLEZ, J. G., GARCÍA-ALANÍS, K. G., TORRES-ALVAREZ, C., DARES-SÁNCHEZ, K., SZYMANSKI, A., … & CASTILLO, S. Effect of Three Types of Drying on the Viability of Lactic Acid Bacteria in Foam-Mat Dried Yogurt. Processes, v. 9, n. 12, p. 2123, 2021.

12. BABA, A. S., NAJARIAN, A., SHORI, A. B., LIT, K. W., & KENG, G. A. Viability of lactic acid bacteria, antioxidant activity and in vitro inhibition of angiotensin-I-converting enzyme of Lycium barbarum yogurt. Arabian Journal for Science and Engineering, v. 39, n. 7, p. 5355-5362, 2014.