EXTRAÇÃO E RECUPERAÇÃO DE COMPOSTOS BIOATIVOS           DA Stachys byzantina (peixinho da horta)

Capítulo de livro publicado no livro do I Congresso Latino-Americano de Segurança de Alimentos. Para acessa-lo  clique aqui.

DOI: https://doi.org/10.53934/08082023-21

Este trabalho foi escrito por:

Stefanie Calisto Casarin ^*; Pamela da Silva Souza ; Flávia Aparecida Reitz Cardoso ; Adriana Aparecida Droval ; Renata Hernandez Barros Fuchs ; Leila Larisa Medeiros Marques *

 *Autor correspondente (Corresponding author) – Email:[email protected]

aUniversidade Tecnológica Federal do Paraná (UTFPR), Paraná, Brasil

RESUMO

O presente estudo teve como objetivo a extração de compostos bioativos utilizando banho  ultrassônico, avaliando-se a recuperação de compostos bioativos da Stachys byzantina, a peixinho da horta – uma PANC (planta alimentícia não convencional) – com dois tipos de solventes eutéticos profundos naturais (NADES) a base de ácido lático, incluindo cloreto de colina e l-prolina, acrescidos de 50% de água para diminuição da densidade. A extração foi realizada por banho ultrassônico e os tempos de extração utilizados foram 5, 10 e 15 min.  Após a extração, foram aplicados métodos para determinação de compostos bioativos, a partir de curvas padrão, a fim de obter a quantidade de flavonoides recuperados na extração por meio do método utilizando o reagente Folin-couteau, e a atividade antioxidante pelas metodologias FRAP e DPPH. Ambos os solventes eutéticos destacaram-se na extração de compostos bioativos. Entretanto, a combinação de cloreto de colina + ácido levulínico, no tempo de 10 min, trouxe melhores resultados quanto à atividade antioxidante e quantidade de flavonoides extraídos (0,34±0,05 mg Equivalente de Quercetina (EQ).g^-1 para flavonoides e 0,44±0,01µmol Equivalente de Trolox (ET).g^-1 e 0,43±0,00 ET.g^-1 para determinação da atividade antioxidante pelos métodos FRAP e DPPH, respectivamente). A S. byzantina mostrou-se uma excelente fonte de antioxidantes, mostrando-se promissora a sua aplicação em alimentos a longo prazo. Os NADES utilizados neste estudo mostraram-se eficientes na extração de bioativos, apresentando resultados semelhantes a extrações com metanol, quando comparado com outros autores. 

PALAVRAS-CHAVE: Antioxidante, banho ultrassônico, extratos de plantas, NADES

ABSTRACT

The present study aimed to extract bioactive compounds using an ultrasonic bath, evaluating the recovery of bioactive compounds from Stachys byzantina, “peixinho da horta” – a PANC (unconventional food plant) – with two types of natural deep eutectic solvents (NADES) based on lactic acid, including choline chloride and l-proline, plus 50% water to decrease density. The extraction was performed by ultrasonic bath and the extraction times used were 5, 10 and 15 min. After extraction, methods were applied for the determination of bioactive compounds, from standard curves, to obtain the number of flavonoids recovered in the extraction through the method using the Folin-couteau reagent, and the antioxidant activity by the FRAP and DPPH methodologies. Both eutectic solvents stood out in the extraction of bioactive compounds. However, the combination of choline chloride + levulinic acid, within 10 min, brought better results regarding antioxidant activity and amount of flavonoids extracted (0.34±0.05 mg Quercetin Equivalent (EQ).g^-1 for flavonoids and 0.44±0.01µmol Trolox Equivalent (ET).g^-1 and 0.43±0.00 ET.g^-1 for determination of antioxidant activity by FRAP and DPPH methods, respectively). S. byzantina proved to be an excellent source of antioxidants, proving to be promising for its long-term application in foods. The NADES used in this study proved to be efficient in the extraction of bioactives, presenting similar results to extractions with methanol, when compared to other authors.

KEYWORDS: Antioxidants; ultrasonic bath; plant extracts; NADES

INTRODUÇÃO

Nos dias atuais, com a crescente preocupação populacional em levar um estilo de vida mais saudável, fala-se cada vez mais na inserção de frutas, legumes e vegetais nas dietas, e nos efeitos benéficos dos mesmos a saúde, principalmente para prevenção de doenças patológicas crônicas, incluindo câncer, doenças cardiovasculares, diabetes tipo-2 e Alzheimer (1). A prevenção dessas doenças por meio do consumo de frutas, vegetais e legumes, se dá pelos compostos bioativos neles presentes, que possuem, em geral, ação antioxidante e anti-inflamatória (4).

Dentre as plantas que exibem esses importantes bioativos para saúde estão as PANCs – plantas alimentícias não convencionais- que segundo Terra e Ferreira são plantas que possuem uma ou mais partes que podem ser consumidas pelos seres humanos, sendo elas espontâneas, cultivadas, nativas ou exóticas, que não estão incluídas em nossos cardápios cotidianos. Já segundo Silva (3), a Stachys byzantina K. Koch ou Stachys lanata L. é uma PANC popularmente conhecida como peixinho da horta ou orelha de lebre, pertence à família Lamiaceae e é originária da Turquia, da região da Ásia e do Cáucaso. Porém, pode ser encontrada em regiões com temperaturas entre 5 e 30°C, de clima ameno (4). No Brasil, seu cultivo normalmente se dá para consumo em empanados, por exemplo. Segundo Azevedo (4), a S. byzantina possui alto teor de proteínas, tendo 12% de proteínas em sua composição, sendo uma boa fonte de proteína vegetal e auxiliando em dietas livres de proteínas animais. Estudos apontam também que a S. byzantina é rica em compostos nutracêuticos, possui alta concentração de minerais e níveis altos de vitamina C e K, possuindo potencial antioxidante, antidiabético e antiobesidade (3). Assim, os compostos bioativos da S. byzantina podem ser de grande utilidade na indústria de alimentos, uma vez que esses compostos trazem diversas vantagens para nutrição e saúde humana.

A extração de compostos bioativos vegetais utilizando solventes orgânicos tradicionais, são, em geral, de baixo custo, mas pode ser tóxica para extração em alimentos (3). Além disso, ainda há preocupação com os compostos liberados no meio ambiente pelos solventes tradicionais. Com isso, os solventes verdes vem sendo cada vez mais apontados como substituição aos tradicionais.  Os solventes eutéticos profundos naturais (NADES), segundo Silva (3), são considerados decorrentes dos solventes ecológicos, são pouco voláteis, termicamente estáveis e não inflamáveis. Por apresentar tais atributos, um estudo dos NADES é muito interessante, aliado a “promessa” da Stachys byzantina de ser uma planta rica em bioativos. Portanto o presente estudo objetiva quantificar atividade antioxidante e de flavonoides, ampliando o conhecimento a respeito da Stachys byzantina e dos NADES.

MATERIAIS E MÉTODOS

A S. byzantina foi cultivada por 6 meses e logo após, colhida do canteiro da Universidade Tecnológica Federal do Paraná, campus Campo Mourão, conforme mostrado na Figura 1, higienizada em água corrente e secas em estufa de circulação de ar forçada (Cienlab) a 45°C, por um período de 8h, até peso constante, conforme Figura 2. Logo após, foram trituradas, identificadas e armazenadas em freezer.

Foram coletadas 1,7 kg de folhas saudáveis in natura de Stachys byzantina da horta da Universidade Tecnológica Federal do Paraná –campus Campo Mourão. Em seguida,          as combinações 1 e 2 de solventes foram pesadas (pesos e componentes das combinações estão indicados na Tabela 1) e levadas ao agitador magnético (Lutech), a temperatura de 80°C com agitação de 50 rpm, até que se transformasse em líquidos límpidos de uma única fase, livre de sólidos visíveis. Após resfriamento e com os solventes em temperatura ambiente, foi adicionada água destilada para diminuição da densidade dos solventes, em proporção de 50%. Em seguida, os NADES foram acondicionados em frasco âmbar, identificados e armazenados em dessecador.

Para a realização das extrações, inicialmente foram pesadas em balança analítica triplicatas com 0,314g de amostra (peixinho da horta) em tubos de Falcon e adicionados 2,5 mL de NADES por amostra. Esta mistura foi submetida a banho ultrassônico, na temperatura de 50°C, frequência de 37 Hz, potência de 30% durante o período de 5 min. Retirou-se o solvente (com compostos bioativos) e reservou-se em béquer. A amostra sólida então seguiu para uma segunda  extração, repetindo o processo anterior. Esse procedimento foi repetido para os tempos de 10 e 15 min, respectivamente. Após a extração das amostras, os béqueres     foram identificados e reservados em freezer para posteriores análises dos compostos bioativos. Foram realizadas pesagens posteriores as extrações para comparativo de massa e análises para quantificação de flavonoides e determinação da atividade antioxidante pelas metodologias FRAP e DPPH. As análises foram feitas em ambiente escuro e as leituras foram realizadas em espectrofotômetro Uv- Vis (Global Analyzer). As técnicas aplicadas e sua metodologia, assim como padrão e concentração da curva estão dispostas na Tabela 2.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os resultados foram obtidos por meio das curvas de calibração descritas. Assim tem-se para flavonoides, y= 0,137x + 0,0516 com R²= 0,9980 para o padrão quercetina. Para FRAP, y=0,000797x + 0,00885 com R² = 0,9646 e DPPH, y=-0,104x+ 0,808 com R² = 0,9619, ambos utilizando o padrão trolox.

Analisando-se os dados da Tabela 3 em relação ao comparativo de massa verifica-se que não há diferença significativa entre a absorção da peixinho em relação aos NADES L-prolina + ácido levulínico e cloreto de colina + ácido levulínico, nos tempos de 5, 10 e 15 min. Com relação ao DPPH, que mede a atividade antioxidante por meio de compostos bioativos envolvidos na desativação de radicais, os maiores valores de atividade antioxidante foram determinados para cloreto de colina + ácido levulínico (0,48±0,01µmol ET.g^-1) no tempo de 5 min e L-prolina + ácido levulínico (0,45±0,02 µmol ET. g^-1) no tempo de 15 min, sem apresentar diferença significativa entre as médias. O menor valor do DPPH ficou com o solvente cloreto de colina + ácido levulínico (0,19±0,01µmol ET. g^-1) no tempo de extração de 15 min. Para a quantificação dos flavonoides, o solvente L-prolina + ácido levulínico (0,34±0,05 mgEQ.g^-1) apresentou maior valor do tempo de 10 min de extração, enquanto que a extração em 5 min apresentou menor valor na extração de flavonoides para os dois solventes empregados, (0,16±0,02 mg Q. g^-1) e (0,16±0,00 mg EQ. g^-1), para L-prolina + ácido levulínico e cloreto de colina + ácido levulínico, respectivamente. Na metodologia por FRAP, que mede a atividade antioxidante por meio do nível de redução de ferro a atividade antioxidante manteve a mesma média significativa para a extração de Cloreto de colina + ácido levulínico (0,43±0,00 µmol ET. g^-1) em 5 min e L-prolina + ácido levulínico (0,44±0,01 µmol ET.g^-1) em 10 min de extração como mostrado na Tabela 3.

Considerando os maiores valores de encontrados de flavonoides e atividade antioxidante (por FRAP e DPPH), tem-se que a melhor combinação de solventes e o melhor tempo é o NADE Cloreto de colina + ácido levulínico, no tempo de 10 min. Deve- se levar em consideração também que pode haver diferenças nas análises realizadas para atividade antioxidante, uma vez que o método FRAP mede a atividade antioxidante por meio do nível de redução de ferro e o DPPH, por meio dos compostos bioativos envolvidos na desativação de radicais. Além desses métodos, existem outros métodos que buscam outras propriedades para realizar a análise, como ABTS que mede a atividade antioxidante por meio da captura do radical.

Silva et al. (10) estudaram a extração e recuperação de flavonoides na Melissa officinalis também pertencente à família Lamiaceae obtendo valores de 228 μg EQ.g^-1 em extração por decocção com água destilada, valores semelhantes aos encontrados no presente trabalho, tanto na extração a base de ácido levulínico no tempo de 10 min e tendo até superado esse valor com L-prolina + ácido levulínico, no tempo de 10 e 15 min. Hmidani et al. (11), em estudos com a família Lamiaceae, constataram um valor de 0,013 μmol ET.g^-1 para inibição de radicais de DPPH na Origanum majorana e 0,023 μmol ET.g^-1 na Lavandula officinalis, em extração com água destilada em incubadora de agitação orbital. Azevedo (3), com a extração de S. byzantina, obteve 0,031 μmol ET.g^-1 para inibição de radicais de DPPH em extração com metanol por meio de ultrassom. Já para FRAP, os valores obtidos foram muito menores que qualquer outro constatado em literatura. Hmidani et al. (11) obtiveram 477,82 μmol ET.g^-1 para a Origanum majorana e 226,82 μmol ET.g^-1 para a Lavandula officinalis.

Assim, pode-se notar que ambos os NADES a base de ácido levulínico no tempo de 10 min obtiveram valores semelhantes, tendo até superado esse valor com L-prolina + ácido levulínico no tempo de 10 e 15 min. Analisando estatisticamente a fim de encontrar os melhores valores extraídos de flavonoides, e a melhor atividade antioxidante pelos métodos FRAP e DPPH, chegou-se à conclusão de que o melhor solvente (NADE) e tempo de extração, seria cloreto de colina + ácido levulínico no tempo de 10 min.

CONCLUSÕES

Por fim, levando em consideração os estudos anteriores, a presente pesquisa evidenciou que o método banho ultrassônico no tempo de 10 min foi o que mais se destacou quanto a extração de bioativos, mostrando que o NADES mais eficiente é a combinação de cloreto de colina + ácido levulínico, acrescido com 50% de água. Isso evidencia que não há necessidade de utilização de um tempo maior na extração, uma  vez que em 10 min extraiu-se mais composto bioativos do que em 15 min. A presente    pesquisa ainda evidencia uma boa fonte de compostos antioxidantes e de flavonoides que é a S. byzantina, mostrando-se uma planta promissora para futura aplicação em alimentos. Ainda, se combinada aos NADES, por serem solventes naturais atóxicos, podem oferecer aplicações seguras em alimentos.

AGRADECIMENTOS

Agradeço à Fundação Araucária, pela bolsa e oportunidade de desenvolver esta pesquisa; à UTFPR pelo fomento na compra de reagentes para pesquisa, à minha orientadora Dra. Leila Marques, sem a qual essa pesquisa não seria possível ; à Dra. Flávia Reitz, pela ajuda na parte estatística; às técnicas de laboratório e todos  que de alguma forma contribuíram para a realização desta pesquisa.

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