ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DA NANOESTRUTURA DE ÓXIDO DE ZINCO FRENTE À ESCHERICHIA COLI E STAPHYLOCCOCUS AUREUS

Capítulo de livro publicado no livro do I Congresso Latino-Americano de Segurança de Alimentos. Para acessa-lo  clique aqui.

DOI: https://doi.org/10.53934/08082023-40

Este trabalho foi escrito por:

  Marília Magalhães Gonçalves^1,2  ;Verônica Costa Reinoso¹ ; Igor José Boggione Santos¹ ;Jane Sélia dos Reis Coimbra²

 1Departamento de Química, Biotecnologia e Engenharia de Bioprocessos, Universidade Federal de São João Del Rei (UFSJ) – Campus Alto Paraopeba, Ouro Branco, Minas Gerais, Brasil 2Departamento de Tecnologia de Alimentos, Universidade Federal de Viçosa (UFV), Viçosa, Minas Gerais, Brasil

*Autor correspondente (Corresponding author) – Email:[email protected]

Resumo: O trabalho investigou a atividade antimicrobiana de nanopartículas de ZnO em relação às bactérias Escherichia coli e Staphylococcus aureus. ZnO nano foi preparada moendo ZnCl₂, NaCl e Na₂CO₃ na proporção 1:5, 5:1 seguido de tratamento térmico, lavagem e filtração. As nanoestruturas foram caracterizadas por espalhamento de luz dinâmico (DLS), microscopia eletrônica de transmissão (TEM) e difração de raios X. O tamanho médio obtido foi de 173,15 ± 13,16 nm. A atividade antimicrobiana das nanoestruturas para S. aureus e E.coli foi determinada por meio de absorbância a 625 nm para diferentes concentrações das nanoestruturas a 37 °C por 50 h. Para o S. aureus, as concentrações 3,00 mg·mL⁻¹, 4,50 mg·mL⁻¹ e 5,63 mg·mL⁻¹ promoveram diminuição significativa na absorbância em relação ao controle e as demais concentrações, de acordo com o Teste de Tukey a 5% de probabilidade, com aumento da fase lag, indicando inibição de crescimento. Para a E. coli a nanoestrutura promoveu diminuição significativa da absorbância em relação ao controle, em todas as concentrações, conforme o Teste de Tukey a 5% de significância. As concentrações de 4,50 mg·mL⁻¹ e 5,63 mg·mL⁻¹ levaram a maior redução na absorbância e inibição do crescimento da bactéria. Pode-se concluir que as nanoestruturas de ZnO são alternativas promissoras para controle destes microrganismos que são um problema na indústria de alimentos.

Palavras–chave: nanotecnologia, concentração inibitória mínima, atividade antimicrobiana

Abstract: This work investigated the antimicrobial activity of ZnO nanoparticles against Escherichia coli and Staphylococcus aureus. ZnO nano was prepared by grinding ZnCl₂, NaCl and Na₂CO₃ in the ratio 1:5, 5:1 followed by heat treatment, washing and filtration. The nanostructures were characterized by dynamic light scattering (DLS), transmission electron microscopy (TEM) and X-ray diffraction. The average size obtained was 173.15 ± 13.16 nm The antimicrobial activity of the nanostructures for S. aureus and E.coli was determined by absorbance at 625 nm for different concentrations of nanostructures at 37 °C for 50 hours. For S. aureus, the concentrations 3 mg·mL⁻¹, 4.5 mg·mL⁻¹ and 5.625 mg·mL⁻¹ caused significant decrease in absorbance in relation to control and the other concentrations, according to the Test of Tukey at 5% probability with increased lag phase, suggesting growth inhibition. For E. coli, the nanostructure promoted a significant decrease in absorbance in relation to the control, in all concentrations, according to the Tukey Test at 5% significance. In the concentrations of 4.5 mg·mL⁻¹ and 5.625 mg·mL⁻¹ that was greatest reduction in absorbance and inhibition of bacterial growth. It can be concluded that ZnO nanostructures are promising alternatives to control these microorganisms that are a problem in the food industry.

Keywords: nanotechnology; minimum inhibitory concentration; antimicrobial activity

INTRODUÇÃO

As nanoestruturas apresentam tamanho nanométrico e uma elevada relação entre área superficial e volume, que lhes confere propriedades físicas, químicas e/ou biológicas diferentes de quando o material está em dimensão micro ou macroscópica. Suas propriedades únicas fazem com que tenham aplicações em diferentes setores, de forma que sua produção vem crescendo muito nos últimos anos.

Muitas nanoestruturas apresentam ação antimicrobiana sem promover resistência, o que as tornam interessantes, do ponto de vista biológico e econômico, como alternativa aos antimicrobianos tradicionais que, a longo prazo, podem causar danos à saúde do consumidor, tais como: alergias, toxicidade e resistência bacteriana (1).

Uma nanoestrutura promissora é a de óxido de Zinco (ZnO – NP). Ela é facilmente obtida por métodos físicos, químicos e biológicos (2) e tem demonstrado ação antimicrobiana contra fungos e bactérias, incluindo esporos resistentes (3). Além disso, não são consideradas tóxicas aos seres vivos e meio ambiente, sendo reconhecidas como seguras pela Food and Drug Administration (FDA) estando na lista de compostos Geralmente Reconhecidos como Seguros (GRAS) (4).

Escherichia coli é um microrganismo gram-negativo, habitante natural do trato gastrointestinal de homens e animais, mas que apresenta cepas com características de virulência em diferentes graus (5). Desta forma, é um contaminante que precisa ser controlado na indústria de alimentos, por meio de Boas Práticas de Fabricação, pois podem causar infecções de origem alimentar.

Staphylococcus aureus é um patógeno gram-positivo envolvido em processos infecciosos que acometem humanos e animais. É capaz de produzir enterotoxinas estafilocócicas que resultam em intoxicações alimentares, sendo uma das doenças transmitidas por alimentos mais comuns (6). Sendo encontrado naturalmente na pele, cabelo e membranas mucosas, a contaminação de alimentos e superfícies de contato é atribuída ao manuseio inadequado, sem observar práticas de higiene (7).

Tendo em vista que patógenos transmitidos por alimentos podem causar diarreia grave, infecções com sérias consequências, além de prejuízos econômicos, é necessário desenvolver e aprimorar métodos de controle destes agentes nas indústrias e estabelecimentos que manipulam alimentos.

Considerando que as nanopartículas têm demonstrado propriedades antimicrobianas, este trabalho tem como objetivo verificar a ação antibacteriana da Nanoestrutura de Óxido de Zinco contra S. aureus e E. coli e possibilidade de sua aplicação em substituição aos agentes de controle utilizados atualmente.

MATERIAL E MÉTODOS

Cloreto de zinco, cloreto de sódio e carbonato de sódio foram adquiridos da Dinâmica Química Contemporânea Ltda (Brasil), caldo nutriente adquirido da Himedia Laboratories LLC. Foram utilizados produtos químicos de grau analítico, reagentes e água destilada. As bactérias Staphyloccocus aureus 23235 (ATCC) e a bactéria Escherichia Coli 8729 (ATCC) foram cedidas pelo laboratório de Microbiologia do Campus Alto Paraopeba-UFSJ.

MÉTODOS

Produção da Nanoestrutura de Óxido de Zinco

A nanoestrutura de óxido de zinco foi obtida moendo ZnCl₂, NaCl e Na₂CO₃ na proporção 1:5, 5:1, de acordo com Aghababazadeh et al. (2006) (8) e AO et al. (2006) (9) com algumas modificações de otimização realizadas pelo Grupo de Pesquisa Nanotec que obteve o tamanho médio de 173,15 ± 13,16 nm. Os reagentes foram misturados e submetidos a tratamento térmico de 400 ºC por 30 min em um cadinho de porcelana. Ao final do tratamento térmico, o pó foi lavado em água deionizada e filtrado à vácuo. O filtrado foi descartado e a torta de filtração foi seca em estufa a 50 ºC para posterior caracterização e utilização.

Caracterização Morfológica das Nanoestruturas

A caracterização morfológica das nanoestruturas foi feita em trabalho anterior deste grupo de pesquisa, conforme descrito em (10).

O tamanho da nanoestrutura e o índice de polidispersão (PDI) foram determinados por espalhamento de luz dinâmico (DLS, Zetasizer Nano S, Malvern Instruments Ltd, Inglaterra). O equipamento possui um detector de fotodiodo de avalanche (Brookhaven BI-APD, USA) e um correlacionador (TURBOCORR, Brookhaven, USA). A fonte de luz (CVI Melles Griot, USA) foi um laser HeNe de 35 mW de potência e λ = 632,80 nm, linearmente polarizada. A estabilidade da nanoestrutura armazenada a 25 °C foi avaliada durante os dias 0, 1, 3, 7, 15, 30, 60 e 90 analisando o tamanho e potencial Zeta no equipamento Zetasizer Nano S. O pó obtido foi armazenado em temperatura ambiente e, após os dias pré-estabelecidos, uma concentração de 0,1% m/m em água foi analisada ​​no Zetasizer. Todos os experimentos foram realizados em triplicata.

Imagens de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) foram obtidas no Laboratório Nacional de Nanotecnologia (LNNano) no Centro Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais (CNPEM). O microscópio utilizado foi um TEM JEOL-1400 PLUS (120 kV), com filamento de Hexaboreto de Lantânio (LaB₆), equipado com uma câmera Gatan OneView com 4K × 4K pixel. Antes da fixação da amostra nas grids de cobre, essas grids foram descarregadas eletricamente pelo sistema de descarga Pelco easiGlow-Ted Pella (EUA) a 15 mE por 10s com o objetivo de melhorar a molhabilidade delas.  Posteriormente, uma gota da suspensão produzida de nanoestrutura de proteína a 2 mg·mL^-1 foi adicionada à grid de cobre de 400 mesh com filme de carbono. Após 30 s, o excesso da amostra foi retirado com papel de filtro, e, em seguida, uma gota de solução aquosa de contrastante acetato de uranila a 2% (m/v) foi adicionada sobre a grid, que foi mantida em temperatura ambiente até secar e depois observada por TEM.

A difração de raios X foi realizada em Miniflex 600 (Rigaku). O pó foi colocado sobre a superfície em uma tela de vidro e analisada por varredura de 5 a 80 (θ), a uma velocidade de 2 θ/min e um ritmo de 0,020, com corrente de 15 mA em 45 kV.

Avaliação da Atividade Antimicrobiana das Nanoestruturas

Os ensaios foram realizados de acordo com Orellano et al. (2019) (11). Culturas de Staphylococcus aureus e Escherichia coli, crescidas overnight a 37 ^oC, foram distribuídas em microplacas de 96 poços juntamente com a nanoestrutura de óxido de zinco em diferentes concentrações.  Em cada poço da placa foram colocados 115,0 μL de caldo nutriente e 10,0 μL de uma das bactérias, água e nanoestruturas conforme esquema abaixo:

linha A: 0,0 μL de nanoestrutura e 75,0 μL de água destilada;

linha B: 1,0μL de nanoestrutura e 74,0 μL de água destilada;

linha C: 2,0 μL de nanoestrutura e 73,0 μL de água destilada;

linha D: 4,0 μL de nanoestrutura e 71,0 μL de água destilada;

linha E: 40,0 μL de nanoestrutura e 25,0 μL de água destilada;

linha F: 60,0 μL de nanoestrutura e 15,0 μL de água destilada;

linha G: 75,0 μL de nanoestrutura e 0,0 μL de água destilada.

A absorbância do sistema foi lida a 625,0 nm e 37ºC em um leitor de microplacas de hora em hora durante 50 h.

Análises estatísticas

Os resultados deste trabalho foram analisados usando Excel 2010 e software estatístico OriginPro 2016. Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância (ANOVA), e as médias foram comparadas utilizando o teste de Tukey a 5% de significância.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Caracterização da Nanoestrutura de ZnO

Conforme verificado por Costa et al. (2023) (10), a nanoestrutura de óxido de zinco produzida apresentou tamanho de 173,15 ± 13,16 nm e PDI de 0,601. Além de morfologia esférica, tendência a aglomeração e estabilidade de tamanho de 90 dias com um potencial Zeta de -24,20 mV.

Avaliação da Atividade Antimicrobiana da Nanoestrutura de ZnO

A Figura 1 mostra a atividade antimicrobiana das nanoestruturas de ZnO contra E. coli e S. aureus. Na Figura 1, concentrações de 0,075 a 0,300 mg·mL⁻¹ de ZnO nano apresentaram valores próximos ao controle. O teste de Tukey com nível de significância de 5% indicou que não houve diferença significativa entre os valores obtidos nestas concentrações e o controle. Nas concentrações 3 mg·mL⁻¹, 4,5 mg·mL⁻¹ e 5,63 mg·mL⁻¹ houve uma diminuição significativa na absorbância em relação ao controle e as demais concentrações, de acordo com o Teste de Tukey, nas concentrações 4,5 mg·mL⁻¹ e 5,63 mg·mL⁻¹ a fase lag de crescimento foi adiada por conta da atividade antimicrobiana da nanoestrutura de ZnO, Nas concentrações 4,5 mg·mL−1 e 5,63 mg·mL−1 observou-se aumento da fase lag para S. aureus, porém, após 30h a bactéria iniciou seu crescimento. Isto provavelmente aconteceu porque a nanoestrutura de  ZnO possui atividade bacteriostática e não bactericida, sendo este um comportamento esperado. Mas não foi encontrada diferença significativa entre elas. Observa-se nestas concentrações um aumento da fase lag de crescimento do S. aureus, o que indica que houve inibição da multiplicação do microrganismo.

Na Figura 2, para E. coli, observa-se que a adição de nanoestrutura promoveu diminuição significativa da absorbância em relação ao controle, em todas as concentrações, conforme o Teste de Tukey a 5% de significância. As concentrações de 4,5 mg·mL⁻¹ e 5,63 mg·mL⁻¹ levaram a maior redução na absorbância e inibição do crescimento da bactéria de acordo com o teste de Tukey, mas não apresentaram diferença significativa entre elas. A menor concentração de nanoestrutura utilizada, que promoveu redução no crescimento do microrganismo foi 0,075 mg·mL⁻¹ .

Padmavathy & Vijayaraghavan (2008) (12), apontam vantagens de se utilizar antibacterianos de origem inorgânica em relação aos orgânicos. São mais duráveis, seletivos, resistentes a condições como altas temperaturas e apresentam atividade elevada, mesmo em pequenas quantidades. No caso das nanopartículas de ZnO, estas ainda apresentam toxicidade seletiva para bactérias e efeitos mínimos para células humanas (13)

Para compreensão do mecanismo antimicrobiano da nanoestrutura de ZnO é importante estudar a ligação específica da superfície do agente e seu consequente metabolismo no interior do microrganismo.  De acordo com (14) o efeito antimicrobiano das nanopartículas de óxido de zinco se deve à produção de espécies altamente reativas de oxigênio (ROS) (OH, H₂O₂, O₂), que se ligam ao microrganismo e podem penetrar nas células causando danos.

Num estudo que avaliou o efeito bactericida de dispersões com diferentes tamanhos de nanopartículas de ZnO, Padmavathy & Vijayaraghavan (2008) (12) verificaram que para menores tamanhos de partículas, a atividade antimicrobiana é maior, provavelmente em virtude da maior relação superfície volume, permitindo a ligação de maiores quantidades de espécies reativas de oxigênio.

CONCLUSÕES

Os resultados obtidos neste trabalho mostram que as nanoestruturas de ZnO têm efeito na redução e inibição do crescimento das bactérias E. coli e S. aureus, importantes patógenos que precisam ser controlados na indústria de alimentos. A ação bactericida foi dependente da concentração das nanoestruturas e a E. coli foi mais sensível.

Desta forma, o estudo aponta para a possibilidade de aplicação destas nanopartículas como agentes antimicrobianos que podem ser utilizados, por exemplo, em superfícies de contato de alimentos na indústria.

Sugere-se estudos futuros comparando o efeito de sanitizantes comerciais com as nanopartículas. Além de estudos sobre a segurança de seu uso na indústria alimentícia.

AGRADECIMENTOS

Agradecemos à CAPES, CNPQ e FAPEMIG pelo apoio financeiro.

REFERÊNCIAS

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3.        Jamdagni P, Khatri P, University-Science JRJ of KS, 2018 undefined. Green synthesis of zinc oxide nanoparticles using flower extract of Nyctanthes arbor-tristis and their antifungal activity. Elsevier [Internet]. [cited 2023 Jun 4]; Available from: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1018364716303202

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8.        Aghababazadeh R, Mazinani B, Mirhabibi A, Tamizifar M. ZnO nanoparticles synthesised by mechanochemical processing. iopscience.iop.org [Internet]. 2006 [cited 2023 Jun 4]; Available from: https://iopscience.iop.org/article/10.1088/1742-6596/26/1/075/meta

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