CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA PARA A SEPARAÇÃO DE COMPOSTOS BIOATIVOS NO CACAU E SEUS DERIVADOS: UMA REVISÃO DE LITERATURA

Capítulo de livro publicado no livro do I Congresso Latino-Americano de Segurança de Alimentos. Para acessa-lo  clique aqui.

DOI: https://doi.org/10.53934/08082023-01

Este trabalho foi escrito por:

Natalia Costa da Silva ^*; Edilaine Alves da Silva ; Samarone Xavier da Silva ; Ilma Matias Santos Silva ; Lucas Caldeirão Rodrigues Miranda ; Helena Teixeira Godoy  

*Autor correspondente (Corresponding author) – Email: [email protected]

Resumo: O cacau é um fruto rico em compostos bioativos, estes fornecem características funcionais a esse produto e seus derivados, com os benefícios a saúde relacionada ao seu consumo bem documentado na literatura. Atualmente a busca pelo melhor entendimento do comportamento desses compostos bioativos durante a cadeia produtiva do cacau e o desenvolvimento de técnicas analíticas de separação, identificação e quantificação desses analitos vem sendo objeto de estudos de muitos pesquisadores ao longo dos anos. Sendo assim, esta revisão de literatura fornece um panorama das principais técnicas analíticas usadas na separação de compostos bioativos no cacau e seus produtos derivados, sobretudo o uso da Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada a detectores de arranjo de diodos e florescência. Além disso, busca apresentar alguns dos protocolos para preparo de amostras dessa matriz comumente utilizadas a partir dos artigos analisados nesta revisão.  As buscas se basearam em pesquisas disponíveis na íntegra, com data de publicação definida entre 2005 e 2023, coletando 42 trabalhos entre artigos de pesquisa, trabalhos de conclusão de curso, dissertações e teses em diferentes bancos de dados eletrônicos: Scientific Electronic Library Online, PubMed, Science Direct, Scopus, Web of Science e Google Acadêmico. Ao avaliar os métodos analíticos cromatográficos utilizados nas pesquisas científicas, entendemos a necessidade da avaliação das condições que podem melhorar a eficiência dos métodos cromatográficos, além da importância da coleta de informações sobre esses compostos que podem contribuir com o controle de qualidade da matéria-prima e otimização das etapas de processamento longo da cadeia produtiva do cacau.

Palavras–chave: análise, bioativos, cacau, HPLC

Abstract: Cocoa is a fruit rich in bioactive compounds, which provide functional characteristics to this product and its derivatives, with health benefits related to its consumption well documented in the literature. Currently, the search for a better understanding of the behavior of these bioactive compounds during the cocoa production chain and the development of analytical techniques for separation, identification and quantification of these analytes has been the subject of studies by many researchers over the years. Therefore, this literature review provides an overview of the main analytical techniques used in the separation of bioactive compounds in cocoa and its derivatives, especially the use of High Performance Liquid Chromatography coupled to diode array and fluorescence detectors. In addition, it seeks to present some of the protocols for preparing samples of this matrix commonly used from the articles analyzed in this review. The searches were based on research available in full, with publication date defined between 2005 and 2023, collecting 42 papers including research articles, course completion papers, dissertations and theses in different electronic databases: Scientific Electronic Library Online, PubMed , Science Direct, Scopus, Web of Science and Google Scholar. When evaluating the chromatographic analytical methods used in scientific research, we understand the need to evaluate the conditions that can improve the efficiency of the chromatographic methods, in addition to the importance of collecting information about these compounds that can contribute to the quality control of the raw material and optimization of the long processing stages of the cocoa production chain.

Keywords: Analysis; Bioactive; Cocoa; HPLC

INTRODUÇÃO

A produção mundial de cacau aumentou aproximadamente 18% nos últimos dez anos. Essa demanda tem sido associada não apenas às suas características sensoriais únicas, mas também por seus compostos benéficos à saúde humana (1). Esses benefícios estão associados à presença de compostos bioativos que exercem ações biológicas no organismo humano (2).

A cadeia produtiva do cacau é complexa e envolve diversas etapas importantes (produção da matéria-prima, processamento e distribuição dos produtos) que ocorrem separadamente e em longas distâncias (3). Por exemplo, os principais produtores de cacau são Costa do Marfim com 42,63% de toda produção mundial, seguida dos países Gana (20,45%). Entretanto, mais da metade do cacau é processada em regiões não produtoras da amêndoa, como a Europa, que processou 36%, e os EUA, com 8% do volume mundial de 2019. (4,5,6).

O atual processamento do cacau envolve etapas como a fermentação, secagem e torra que promovem diversas reações químicas e bioquímicas responsáveis pelo desenvolvimento do aroma e sabor característico. Por outro lado essas reações degradam os compostos bioativos, sendo eles percussores de sabor amargo e adstringente, acaba sendo desejável que essa degradação aconteça (7). No entanto, a partir da popularização dos benefícios dos compostos fenólicos à saúde tem provocado grande interesse em mantê-los durante o processamento, para isso é necessário otimizar as etapas de processamento sem prejuízo ao sabor e a composição fenólica dos produtos. Além de entender como esses compostos se comportam ao longo da cadeia produtiva do cacau (8).

Para auxiliar nessas descobertas a aplicação de técnicas de determinação da composição química e físico-química de alimentos são uma importante ferramenta para se obter importantes informações sobre a matriz de interesse (9). Essas informações podem ser utilizadas para rastrear o produto quanto à sua origem, qualidade sensorial, nutricional, determinar a concentração e/ou isolamento de um composto de interesse. Além de detectar adulterações e contaminantes, auxiliando no controle de qualidade dos produtos (10). Sendo assim, esta revisão tem como objetivo destacar o uso de técnicas cromatográficas para a separação de compostos bioativos do cacau e seus produtos derivados em diferentes estágios de transformação: das sementes à barra de chocolate, dando ênfase no uso da cromatografia de liquida de alta eficiência (HPLC), como principal técnica utilizada para separação desses compostos devido a sua alta resolução, eficiência, reprodutibilidade e versatilidade.

MATERIAL E MÉTODOS

O presente trabalho é uma revisão sistemática de literatura, onde são descritas pesquisas publicadas em periódicos, sobre compostos bioativos em cacau (Theobroma cacao L.) e produtos derivados, como também o método analítico para separação dos analitos utilizando Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC).

Para analisar a literatura atual, foram coletados artigos de pesquisa, trabalhos de conclusão de curso, dissertações em diferentes bancos de dados eletrônicos: Scientific Electronic Library Online (SCIELO), PubMed, Science Direct, Scopus, Web of Science e Google Acadêmico. Foram revisados um total de 12 trabalhos a partir dos descritores selecionados para a busca: “phenolic cocoa”, “Theobroma cocoa L.” “bioactive”, “HPLC”, “Chemical composition cocoa”, “Extraction of phenolic cocoa”, “cocoa and by-products”. Considerando apenas estudos que utilizaram como técnica analítica a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC).

As buscas se basearam em pesquisas disponíveis na íntegra, com data de publicação definida entre 2005 e 2023, e escritas nos idiomas português, espanhol ou inglês. Que foram lidos na íntegra e extraídos os resultados mais importantes a fim de constar nesta revisão de literatura. Os resultados serão demonstrados de maneira descritiva.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O Cacau e seus compostos bioativos

Originário da América central os grãos de cacau (Theobroma cocoa L.) eram utilizados para produção de uma bebida fermentada à base de água e especiarias. Esta era consumida em rituais religiosos para fins medicinais. Com o passar dos anos a cultura do cacau foi sendo disseminada em vários países, inclusive no Brasil, se tornando uma das commodities mais importante de todo o mundo atualmente (3).

Os produtos obtidos a partir do processamento das sementes de cacau, como licor de cacau, cacau em pó e chocolate, têm recebido muita atenção devido ao seu alto e variado teor de compostos bioativos (10).  Esses compostos bioativos ou fitoquímicos como também são conhecidos, são constituintes nutricionais essenciais e não essenciais que ocorrem naturalmente em pequenas quantidades ou são sintetizados durante o processo tecnológico do cacau, estes conferem características funcionais, além de desempenharem ações biológicas tais como a prevenção de doenças crônicas (2,11,12).

Diversos compostos com ações bioativas já foram identificados no cacau, em que correspondem aproximadamente de 6 a 8% da sua composição química, dentre eles destacam-se as metilxantinas compostas por teobromina (3,7-dimetilxantina) e cafeína (1,3,7- trimetilxantina), além dos flavonóis, sendo os mais abundantes a (+)-catequina e (-)-epicatequina  reportada como o principal flavonol monomérico do cacau, além das procianidinas (B1 e B2), antocianinas e ácidos fenólicos (13).

As metilxantinas (Figura 1) apresentam alto ponto de fusão, sendo termicamente estáveis, são mais solúveis em água quente, sensorialmente são inodoras e incolores, no entanto contribuem sensorialmente para o sabor amargo e adstringente dos produtos derivados do cacau (9). A teobromina é um composto considerado diurético, relaxante muscular e vasodilatador, já a cafeína atua principalmente como estimulante do sistema nervoso central, aumentando a função cognitiva e a atenção do indivíduo (14,15).

Figura 1 – Estrutura química das metilxantinas do cacau

Fonte: Elaborado pela autora

Quanto aos compostos fenólicos (Figura 2) estes representam aproximadamente 10% do total de constituintes do cacau e em produtos derivados, as (+)-catequinas, (-)-epicatequinas, seguida de seus dímeros, procianidina B1 ((-)epicatequina-(4β→8)-(+)-catequina) e procianidina B2 ((-)-epicatequina-(4β)→8)-(-)epicatequina) são anti-inflamatórios, cardioprotetores e inibidores da lipase pancreática (13,16,17). As evidências cientificas permitem que estes grupos de compostos sejam reconhecidos como um indicador de qualidade nutricional de chocolate e produtos derivados (18).

Figura 2- Estrutura química dos compostos fenólicos do cacau

Fonte: Elaborado pelo autora

No entanto, o conteúdo desses compostos é altamente variável. Como por exemplo, maiores quantidades de polifenóis e metilxantinas são encontrados no cacau em pó puro e em produtos com maior porcentagem de cacau em sua composição como o chocolate amargo (1). Outros fatores como genótipo da planta, região e cultivo também influenciam na sua composição, como expostos por Febrianto e Zhu ao avaliarem a composição de compostos bioativos de 26 genótipos de cacau. Além dos processos pós-colheita (19).

Métodos de analíticos para compostos bioativos do cacau

Para a quantificação aproximada de polifenóis, alguns métodos colorimétricos são utilizados em análises de rotina principalmente devido a sua simplicidade. Estes incluem os métodos Folin-Ciocalteu e Pressian-Blue para determinação de compostos fenólicos totais (20). No entanto, estes métodos apresentam algumas limitações devido a sua falta de especificidade, pois existe a possibilidade de interferentes de outros compostos não fenólicos, tais como proteínas e açúcares, causando superestimação do verdadeiro conteúdo de polifenóis (21).

Afim, de obter resultados mais expressivos e confiáveis atualmente são utilizadas técnicas cromatográficas como cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), cromatografia gasosa (GC), cromatografia em contracorrente (CCC) e eletroforese capilar (CE). Essas técnicas podem ser aplicadas para análise qualitativa e quantitativas, bem como para procedimentos de isolamento e purificação de compostos como os polifenóis (18). Os dispositivos utilizados para detecção do sinal na cromatografia baseiam-se nas diferenças das propriedades físicas e químicas entre os eluentes e o analito. Os detectores empregados ao sistema são os espectrômetros de massas (MS), o de arranjo de diodos (DAD) e fluorescência (FLD) (22).

Tanto nos métodos colorimétricos, quanto nos métodos cromatográficos as amostras precisam passar por um tratamento prévio de extração, limpeza e concentração quando se realiza a determinação de compostos bioativos, uma vez que as concentrações desses analitos nas matrizes complexas são baixas (8). Para o preparo de amostras de cacau e de seus produtos derivados, vários métodos têm sido descritos ao longo dos anos, com o objetivo de obter melhor rendimento do analito de interesse, eliminar interferências da matriz, evitando assim problemas nos sistemas de detecção (18).

Considerando que a estrutura física e a composição centesimal das amêndoas de cacau e de seus produtos derivados observaram-se que todos os artigos estudados nesta revisão (Quadro 1) iniciaram o processo de preparo de amostras com a quebra e moagem da matriz, a fim de diminuir o tamanho de partícula das amostras e aumentarem a superfície de contato, geralmente utilizando moinhos ou trituradores. Se tratando de uma matriz que pode conter 30% de lipídeos tornando-se um potencial interferente durante a análise, a técnica de desengorduramento é aplicada. Os métodos mais utilizados para essa finalidade foram à extração sólido-líquido por Soxhlet e extração por solvente (23,24).

No caso das metilxantinas e dos flavanóis, as técnicas aplicadas pela indústria são baseadas em extrações sólido-líquido (SLE) utilizando: Soxhlet, banho-maria, hidrodestilação e maceração ou extração líquido-líquido (ELL) como a extração por solvente ou por partição (21). No entanto, apresentam limitações tais como o uso de uma grande quantidade de solventes, tempo de extração longo e perda de compostos termolábeis (18).

Em amostras de cacau e produtos derivados, alguns dos estudos envolveram solventes orgânicos para a extração de compostos bioativos. Hernández-Hernández et al. (2018) ao identificar e quantificar as concentrações de alguns fenóis individuais como teobromina, ácido cafeico, catequina e epicatequina utilizaram cinco diferentes métodos de extração, sendo o método que apresentou melhor desempenho para quantificar a composição de compostos bioativos foi a extração com água acidificada e metanol 80:20 (v/v), aplicando esse método em 26 genótipos de cotilédones fermentados de cacau. Enquanto Pelàez et al., (2016) utilizou como solventes ácido acético e metanol 85:15(v/v) para extração de metilxantinas e catequina em grãos frescos, fermentados e líquor de cacau.

Outras opções de extrações de flavonoídes vêm sendo estudadas, as chamadas extrações verdes, tem como objetivo de diminuir a quantidade de resíduo gerado por essas análises, otimização de tempo de análise, além da substituição de solventes orgânicos, por opções ecologicamente corretas. O uso de extração assistida por ultrassom (USAE), micro-ondas (MWE) extração por fluido supercrítico (SFE) e extração por líquido pressurizado (PLE) são algumas das alternativas (25). Autores como Quiroz-Reyes, et al. (2021) avaliaram as técnicas de extração assistida por ultrassom contínuo e pulsado para obter extratos de grãos de cacau enriquecidos com antioxidantes, Razola-Díaz , et al. (2023) por sua vez também utilizou o ultrassom para extração de compostos bioativos em cacau em pó, ambos em seus achados experimentais comprovaram maiores rendimentos nas classes de flavonoídes e teor de fenólicos totais, além da redução de tempo de extração quando comparados a trabalhos que utilizaram técnicas sólido-líquido convencionais.

Vale ressaltar que a eficiência do processo de extração é influenciada pela relação sólido-líquido (S/L), tempo, temperatura, pH do meio, entre outros. Portanto, é essencial otimizar as condições de extração para maximizar a eficiência da extração (26).

A cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) é a técnica analítica mais empregada para separação de metilxantinas e flavonoídes, devido à sua versatilidade, precisão, rapidez e detecção altamente sensível (18). Além da vantagem de quantificação de vários analitos na mesma análise. Esta técnica analítica consiste na injeção de uma amostra líquida em uma coluna com partículas microporosas (fase estacionária), onde os componentes da amostra são transportados ao longo dessa coluna por um líquido (fase móvel) (22). As substâncias com maior afinidade pelo solvente movem-se mais lentamente. Já as com menor afinidade movem-se mais rapidamente. Ao sair da coluna, os componentes passam por um detector que emite um sinal elétrico o qual é registrado, constituindo um cromatograma (8,27).

Todos os estudos supracitados no Quadro 1, utilizaram a técnica cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) como técnica de separação dos compostos majoritários do cacau como teobromina, cafeína, catequina, epicatequina e procianidinas, além de antocianinas. Colunas de fase ligada ou fase reversa (RP) C18 à base de sílica também foram as mais utilizadas, essas colunas comumente são utilizadas devido aos compostos analisados serem maioritariamente polares e altamente solúveis em água, e tem como objetivo separar as moléculas neutras em solução com base na sua hidrofobicidade (28). Outro fator é sua composição, por ser a base de sílica se tornam mais econômicas e versáteis, disponíveis numa grande variedade de formas, tamanhos e porosidade (22). O diâmetro médio de partículas dos recheios das colunas utilizados foi de 3 a 5 μm. Os sistemas de solventes usados em HPLC analítico incluem eluições de gradiente binário e, ocasionalmente, eluição isocrática. O uso de solventes de ácido acético, fórmico ou fosfórico aquoso com metanol (MeOH) ou acetonitrila (ACN) como modificador orgânico é comum (29). A faixa de força do solvente usada nas eluições de gradiente e o tempo necessário para a separação analítica dependem do número e do tipo de compostos fenólicos na mistura. Gradientes são empregados com misturas complexas. E métodos isocráticos podem ser usados para extratos parcialmente purificados ou extratos brutos contendo apenas alguns componentes de polaridade semelhante (8).

O pH e a força iônica da fase móvel são fatores conhecidos por influenciar a retenção de compostos fenólicos na coluna, dependendo da ocorrência de protonação, dissociação ou dissociação parcial. Uma mudança no pH que aumenta a ionização de uma amostra pode reduzir a retenção em uma separação de fase reversa. Assim, pequenas quantidades de ácido acético (2–5%), ácido fosfórico ou trifluoroacético (TFA) (0,1%) são incluídos no sistema de solvente para suprimir a ionização de grupos fenólicos e carboxílicos e, portanto, melhorar a resolução e a reprodutibilidade das execuções (30). Isso é levado em consideração nos artigos que analisaram as metilxantinas e também os flavonoides (31,32,12).

Tendo como função monitorizar o fluxo da fase móvel na saída da coluna, o detector mede de forma contínua propriedades físicas ou físico-químicas da amostra, ou da solução que a contém enviando um sinal, registado por um processador de dados ou por um registador conveniente, que é, geralmente, diretamente proporcional a concentração do componente na amostra. A interpretação desses registos produz dados qualitativos e quantitativos sobre a amostra e os seus constituintes (27). O cromatograma (Figura 3) mostra todos os componentes que adsorvem no comprimento de onda de interesse e a área de pico de cada componente. A área do pico depende do coeficiente de absorção desse componente naquele comprimento de onda (25).

Figura 3. Cromatograma da separação de compostos, por HPLC

Fonte: Elaborado pela autora

Os fenólicos absorvem bem na região UV e o detector mais comumente usados para HPLC é um detector de comprimento de onda variável UV ou UV-Vis, sendo o detector de arranjo de diodos (DAD) e fluorescência (FLD). Nenhum comprimento de onda único é ideal para monitorar todas as classes de compostos fenólicos, pois eles exibem máximos de absorção em diferentes comprimentos de onda, para sensibilidade máxima, geralmente um comprimento de onda próximo ao máximo é desejado, no entanto, na prática, os comprimentos de onda são definidos para a melhor detecção geral de todos os componentes (29). No caso das metilxantinas e dos flavonóis estudados os comprimentos de onda mais utilizados foram de 272 a 280 nm.

É importante destacar que a cromatografia de alta eficiência (HPLC) é uma técnica apenas de separação. Para a identificação e quantificação dos analitos, as áreas de pico são então comparadas com as dos compostos padrão, que são incluídos na amostra antes da injeção (padrão interno) ou injetados separadamente (padrão externo). A partir dos espectros de absorção conhecido, seus níveis podem ser calculados a partir de sua relatividade com o pico do padrão interno (32).

Quadro 1. Levantamento de técnicas de extração e de análise utilizada na determinação de compostos bioativos em cacau e derivados de outros alimentos.

Fonte: Elaborado pelo autora

SLE – Solid-liquid extraction (extração sólido-líquido), USAE – Ultrasound-assisted extraction (extração assistida por ultrassom), HPR – Hot plate reactor (reator de placa quente), PLE – pressurized liquid extraction (extração de líquido pressurizado), ELL – liquid-liquid extraction (extração líquido-líquido), HPLC- high-performance liquid chromatography (cromatografia líquida de alta eficiência), RP – reversed-phase (fase reversa), NP – normal-phase (fase normal), ESI -electrospray ionization (ionização por electrospray), MS/MS- triple quadrupole mass spectrometry (espectrometria de massa triplo quadrupolo) , LC – liquid chromatography (cromatografia líquida); HRMS – nuclear magnetic resonance spectrometry  (espectrometria de ressonância magnética nuclear), MicroTOF-MS – mass spectrometry by flight time (espectrometria de massa por tempo de vôo), DAD- Diode array detector (detector de arranjo de diodos), FLD – fluorescence detection (detector de florescência), UV-Vis – Ultraviolet-Visible Detector  (detector de Ultravioleta-visível)

 CONCLUSÕES

Neste estudo, avaliamos os métodos analíticos cromatográficos, especialmente a cromatografia liquida de alta eficiência acoplada a detectores de arranjo de diodos (DAD) e fluorescência (FLD) para a separação de compostos bioativos em cacau e seus produtos derivados.  Entendendo que para definir o melhor método para separação dos compostos de interesse é necessário avaliar e identificar as condições que melhoram a eficiência do método como as etapas do preparo de amostra, a composição da matriz a ser analisada, além de considerar variáveis como tempo, temperatura e pH do meio.

O conhecimento sobre a composição dos compostos bioativos do cacau está relacionado à aceitação dos produtos finais pelos clientes e ao desenvolvimento de alimentos funcionais à base de cacau. É de suma importância a avaliação de aspectos nutricionais para maior entendimento das reações químicas e bioquímicas que ocorrem durante seu processamento, considerando que essas reações são as responsáveis por conferir aroma e sabor característicos ao chocolate e produtos derivados do cacau. Sendo assim, entendemos a necessidade de estudos sobre a ocorrência, presença e o comportamento de compostos bioativos ao longo do processamento do cacau, sobretudo quando diz respeito ao cacau brasileiro.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e à Universidade Estadual de Campinas (Unicamp) pelo apoio.

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